肠道菌群代谢产物氧化三甲胺与急性缺血性脑卒中的临床特征及预后相关性分析

丁胜，赵宁军，许铁，燕宪亮

脑卒中俗称“中风”,是我国成人致死、致残的首位病因，具有发病率高、复发率高、死亡率高和致残率高的特点[1]。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中2 类。在所有脑卒中患者中，缺血性脑卒中的发生更为常见，约占脑卒中发生率的80%[2]。缺血性脑卒中的危险因素众多。近年来，随着人们对肠道菌群及其产物的认识，不少新的危险因素进入大众的视野。“微生物-肠-脑轴”、“微生物-肠-心轴”的提出更是让我们对心脑血管疾病的认识进入一个新的层面。鉴于肠道菌群及其产物对急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS）的诸多相关危险因素存在极其重要的促进作用，特别是肠道菌群代谢产物氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)在动脉粥样硬化发生发展中的促进作用，更多的焦点聚集在人类肠道菌群及其代谢产物上。本研究旨在探讨TMAO与AIS的临床特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

AIS 组为2019 年8 月至9 月发病24 h 内因AIS急诊入住徐州医科大学附属医院急救中心的患者100 例，年龄32～97 岁，平均（64.89±11.84）岁。纳入标准：①符合2018年中国急性缺血性脑卒中诊治指南诊断标准[3]；②年龄≥18岁；③入院时急性脑梗死发作≤24 h；④签署知情同意书并接受随访。排除标准：①近3个月使用过广谱抗生素；②合并严重心、肝、肾功能障碍；③发病后7 d内出院或因AIS 昏迷无法完成问卷调查者；④患者或其家属拒绝参加此研究。

对照组为同期非心脑血管疾病入住徐州医科大学附属医院的患者100例，年龄34～90岁，平均（66.85±11.18）岁。纳入标准：①年龄≥18岁；②此次为非心脑血管疾病入院。排除标准：①近3 个月使用过广谱抗生素；②合并严重心、肝、肾功能障碍；③此次因急性应激性事件入院；④患者或其家属拒绝参加此研究。

本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准，伦理号：XYFY2019-KL162-01。

1.2 方法

1.2.1 信息采集 采集2 组患者入院时基线资料，包括年龄、性别、体重指数（BMI）、吸烟史、饮酒史、高血压病病史、糖尿病病史、冠心病病史、脑梗死病史、高胆固醇血症病史、高甘油三酯血症病史。AIS组收集的入院时及卒中后90 d电话随访的临床资料还包括入院时高同型半胱氨酸（HCY）血症、高D-二聚体（急诊）、左侧/右侧颈动脉斑块形成情况、房颤病及病史、溶/取栓治疗、美国国立卫生研究院卒中量表(national institute of health stroke scale,NIHSS)评分，卒中后90 d 生存情况、再发脑梗死、改良Rankin量表（modified Rankin scale,mRS）评分等。

1.2.2 样本采集与测定 用EDTA 作为抗凝剂采集标本，AIS组留取入院时空腹血样2 mL；对照组利用其检验中心剩余的血样。所有样本均于采集后6 h内4℃下离心20 min（2500转/分），留取血浆适量-80℃保存。样本收集完后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行TMAO浓度检测。

1.2.3 AIS组亚组分组 AIS组患者根据入院时血浆TMAO浓度由低到高排序，根据四分位数等分成第一、第二、第三、第四四分位数亚组4 个亚组(n=25)。根据AIS组患者卒中后90 d神经功能预后（mRS 评分表示），分为预后良好亚组（mRS 评分≤1分）和预后不良亚组（mRS评分≥2分）。

1.3 统计学处理

利用SPSS22.0软件进行统计分析，对计量资料进行正态性检验，服从正态分布的计量资料以（±s）表示，2组比较采用独立样本t检验，对非正态分布的计量资料采用中位数及四分位间距描述，多组比较采用H检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，若不满足χ2检验条件，采用Fisher 确切概率法。采用Spearman 方法分析AIS 组入院时血浆TMAO 浓度与不服从正态分布的研究指标之间的相关性。对AIS组患者90 d神经功能预后的影响因素进行单因素及多因素Logistic回归分析。检验水准α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者基线资料比较

2组患者基线资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。AIS 组患者入院时血浆TMAO 浓度明显高于对照组[(3.94±0.42)μmol/L，（3.38±0.56）μmol/L，P＜0.05）]。

表1 2 组患者基线资料比较

2.2 AIS组患者各亚组基线资料比较

AIS组患者各亚组基线资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 AIS 组患者各亚组基线资料比较

2.3 AIS组患者各亚组观察指标比较

第四四分位数亚组入院时NIHSS 评分高于第二四分位数亚组(P＜0.05)；4 亚组间卒中后90 d 内再发脑梗死存在差异（P＜0.05）；第四四分位数亚组卒中后90 d 时mRS 评分高于第一、二、三四分位数亚组(均P＜0.05)；4 亚组间卒中后90 d 内生存情况差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 AIS 组患者各亚组观察指标比较

2.4 AIS组患者入院时血浆TMAO浓度与观察指标之间的相关性分析

AIS 组患者入院时血浆TMAO 浓度与入院时NIHSS 评分（r=0.321,P=0.001）、卒中后90 d 内再发脑梗死(r=0.328,P=0.001)、卒中后90 d时mRS评分（r=0.475,P=0.000）呈正相关。

2.5 AIS 组患者卒中后90 d 神经功能预后的单因素及多因素Logistic回归分析

单因素Logistic回归分析显示高胆固醇血症和入院时血浆TMAO浓度、入院时NIHSS评分是AIS患者90 d神经功能预后的危险因素，见表4。对年龄、BMI、糖尿病、高血压、冠心病等因素进行校正后，多因素Logistic 回归分析提示入院时血浆TMAO 浓度和入院时NIHSS 评分是AIS 患者卒中后90 d 神经功能预后不良的独立危险因素，见表5。

表4 AIS 组患者卒中后90 d 神经功能预后单因素Logistic 回归分析

表5 AIS 组患者卒中后90 d 神经功能预后多因素Logistic回归分析

3 讨论

AIS是由多种危险因素作用于脑血管导致以神经功能缺损或神经系统损伤为表现的脑血管疾病。在世界范围内，AIS 是致残的首要原因。尽管AIS的预防、诊断和治疗较前有所进展，但人口老龄化加剧、脑卒中发病年轻化，AIS所带来的负担仍然很大，这将是这个时代的新挑战[4]。AIS的发生与动脉粥样硬化密切相关，动脉粥样硬化是脑血管疾病发生的基础，是AIS的重要危险因素。研究显示动脉粥样硬化的发生与血浆TMAO 水平呈正相关，其面积随血浆TMAO 水平增加而增加[5]。TMAO的来源包括外源性和内源性2 种。但在人类中，绝大多数TMAO来源于肠道菌群产生的TMAO[6]。研究表明TMAO促进动脉粥样硬化的机制主要有:①通过2 种信号通路共同增强血管内膜炎症反应[7]，改变细胞间粘附分子ICAM-1活性，导致泡沫细胞形成[8]；②通过增加巨噬细胞表面CD36和清道夫受体A数目，引起胆固醇堆积，加速泡沫细胞形成[9]；③作用于合成胆汁酸的关键酶干扰胆固醇的逆转运，促进动脉粥样硬化的发生[10]。TMAO不仅增加动脉粥样硬化的发生，还可通过影响血小板功能，增加粥样斑块破裂后血栓形成的风险[11]。总之，TMAO可通过多种机制促进机体的慢性持续性炎性反应，干扰胆固醇代谢通路、促进血小板聚集等，导致动脉粥样硬化斑块、血栓的形成，进而导致AIS的发生。

有关TMAO与AIS的研究相对较少，有研究显示TMAO可增加首次脑卒中事件在高血压患者的发生率[12]，Liang等[13]实验显示TMAO是缺血性脑卒中的独立预测因子。但另一项研究显示无症状动脉粥样硬化患者肠道微生物和TMAO水平无明显变化，但脑卒中和短暂性脑缺血发作患者因肠道微生物失调，血TMAO水平降低[14]。这使得TMAO与AIS的相关性存在争议。

本实验纳入的AIS患者血浆TMAO浓度存在较大悬殊，入院时血浆TMAO浓度中值是3.95（2.95～4.68）μmol/L，与美国克利夫兰临床中心的检测结果3.7(2.4～6.2)μmol/L 相比较低[15]，这可能是东西方饮食习惯、生活方式的差距造成的。

研究发现与对照组比较，AIS 组患者入院血浆TMAO 浓度高（P＜0.05）。其原因大致有2种可能：一是长期高水平TMAO促进动脉粥样硬化的发生而导致AIS，后者的出现又使肠道通透性增加，进一步增加血浆TMAO 浓度；二是AIS 患者血浆TMAO 水平在发病前与对照组患者无明显差异，因AIS 事件的发生导致肠道通透性增加，菌群转移、菌群失调、血浆TMAO水平升高。这与刘振东等[16]的研究结果相似，但与Yin等[14]的实验结果不同，他们的解释是AIS 事件或卒中后的治疗药物可能降低了血浆TMAO的水平。

AIS 组4 亚组间基线资料差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。相关性分析显示AIS 组患者入院时血浆TMAO 浓度与入院时NIHSS 评分、卒中后90 d 时mRS 评分、卒中后90 d 内再发脑梗死事件呈正相关关系。表明入院时血浆TMAO浓度越高AIS 患者病情往往越重，卒中后90 d时mRS评分高,且卒中后90 d内再发脑梗死的风险也较大，预后不佳。

根据AIS患者的预后（预后良好和预后不良）进行的单因素Logistic回归分析显示，高胆固醇血症、入院时血浆TMAO浓度及入院时NIHSS 评分是AIS 患者卒中后90 d 神经功能预后的危险因素。对年龄、BMI、糖尿病、高血压、冠心病等因素进行校正后，多因素Logistic回归分析提示入院时血浆TMAO浓度、入院时NIHSS 评分是AIS 患者卒中后90 d 神经功能预后不良的独立危险因素。

本实验通过前瞻性观察发现肠道菌群代谢产物TMAO 与AIS的病情评估及预后密切相关，特别是对AIS预后的判断上有重要参考价值。尽管我们对AIS组患者进行严格筛选，对对照组患者入组进行严格限制，使其更具代表性，但仍避免不了存在一定的偏倚。本实验结论仍需大样本、多中心的实验进行验证。

TMAO在心血管事件上的重要意义已得到广泛认可，但在AIS中的意义和价值仍有所争议。本研究通过观察、评估、随访急诊入院的AIS患者，获得第一手且较为及时患者病情资料，具有很好的代表性，这对脑卒中的发病机制研究、预防及治疗有一定临床价值。