Spondin-2 在肝细胞癌组织中的表达及对预后的预测价值

胡亚朋 袁春銮

肝细胞癌（HCC）具有发病率和病死率均较高的特点，给患者的生命安全带来严重威胁[1]。近年来，肝移植术、肝切除术等外科手术快速发展，已被广泛应用于治疗HCC 患者；然而，术后复发率较高仍是临床面临的问题，且转移性HCC 和进展期HCC 患者的5年生存率均较低[2-3]。研究表明，脊椎蛋白-2（Spondin-2）参与了前列腺癌、HCC、卵巢癌等多种恶性肿瘤的发生和进展过程，其与肿瘤细胞的增殖、浸润及迁移等密切相关[4-6]。研究报道，下调Spondin-2 表达能够抑制HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示Spondin-2 在HCC的病程中起着调控作用[7]。目前关于HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者临床病理特征及预后关系的报道较少，本研究对此进行了探讨，以期为HCC 患者的预后预测提供参考依据，并为HCC 提供新的治疗靶点。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年5月至2020年1月连云港市第一人民医院收治的89 例HCC 患者作为研究对象，其中男性47 例，女性42 例，年龄23～77 岁，平均年龄为（54.19±6.28）岁。纳入标准：（1）符合《原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015年版）》[8]中HCC 的诊断标准，且均经病理检查确诊；（2）接受HCC 根治术；（3）既往未接受放射治疗、化学治疗和介入治疗等其他治疗；（4）Child-Pugh 分级为A 级或B 级；（5）均签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）有远处转移；（3）有肝、肾等重要脏器功能障碍；（4）合并血液系统疾病；（5）合并精神疾病；（6）妊娠期或哺乳期女性；（7）合并自身免疫病。剔除标准：（1）失访者；（2）治疗期间死亡者；（3）依从性较差者。本研究获得医院医学伦理委员会批准（批件号20190425）。

1.2 资料收集

入组患者均接受HCC 根治术，术后切取HCC 组织和癌旁组织（距离肿瘤组织边缘5～8 cm），取材后即刻送至病理科检测。收集入组患者的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移情况、Child-Pugh 分级、肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、TNM 分期和微血管侵犯情况等。术前采集患者静脉血4 mL，3 500 r/min 离心10 min（离心半径6 cm），采集上清液，采用放射免疫法检测血清甲胎蛋白（AFP）水平，采用免疫比浊法检测血清总胆红素（TBil）水平，试剂盒均购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 Spondin-2 的表达水平检测

采用免疫组织化学法检测入组患者HCC 组织和癌旁组织中Spondin-2 的表达水平。组织标本经石蜡包埋、切片，随后灭活、微波抗原修复，用PBS 溶液冲洗2～3 次，加入抗Spondin-2 一抗（购自武汉友联特生物技术有限公司），4 ℃孵育过夜，用PBS 溶液冲洗2～3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗[购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，孵育15 min，用PBS 溶液冲洗2～3 次，使用DAB显色液（购自北京雷根生物技术有限公司）显色，用自来水冲洗2～3 次，苏木精复染，脱水封片。阳性细胞染色等级评分标准：棕黄色记3 分，黄色记2 分，浅黄色记1 分，边缘无染色记0 分。阳性细胞占比评分标准：＞75%记4 分，51%～75%记3 分，26%～50% 记2 分，5%～25% 记1 分，＜5%记0 分。总评分＝阳性细胞染色等级评分×阳性细胞占比评分，总评分为0 分判定为Spondin-2 阴性表达，＞0 分判定为Spondin-2 阳性表达。

1.4 随访

采用电话、门诊复查等方式对89 例HCC 患者进行为期3年的随访。随访起始时间为术后，每3个月随访1 次，当至少有2 种影像学检查结果显示HCC 的典型影像学特征——“快进快出”时判定为复发，随访截至2023年1月31 日或患者复发，记录HCC 患者的无瘤生存情况。

1.5 统计学方法

应用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，以log-rank 检验分析HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者无瘤生存率的关系。采用Cox 比例风险回归模型分析影响HCC 患者复发的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织与癌旁组织中Spondin-2 的表达水平比较

HCC 组织中Spondin-2 的阳性表达率为82.02%（73/89），显著高于癌旁组织（51.69%，46/89），2组的差异有统计学意义（χ2＝18.482，P＜0.001）。

2.2 HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者临床病理特征的关系

由表1 可知，低分化、肿瘤包膜不完整、TNM 分期Ⅲ期、有微血管侵犯者的HCC 组织中Spondin-2 的阳性表达率分别高于中高分化、肿瘤包膜完整、TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、无微血管侵犯者，组间的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者临床病理特征的关系

2.3 HCC 患者术后复发的影响因素分析

随访结果显示，89 例HCC 患者中有7 例失访（其中2 例为Spondin-2 阴性表达，5 例为Spondin-2阳性表达），其余82 例患者中有43 例 （52.44%）复发，39 例（47.56%）未复发。

单因素Cox 回归模型分析结果显示，分化程度、肿瘤包膜完整性、TNM 分期、微血管侵犯和Spondin-2 均是影响HCC 患者术后复发的重要因素（P均＜0.05）。以单因素分析中差异有统计学意义的项目，包括分化程度（中高分化＝0，低分化＝1）、肿瘤包膜完整性（完整＝0，不完整＝1）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期＝0，Ⅲ期＝1）、微血管侵犯（无＝0，有＝1）、Spondin-2（阳性表达＝1，阴性表达＝0）作为自变量，以HCC 患者的预后复发情况（未复发＝0，复发＝1）作为因变量，纳入多因素Cox 回归模型分析，结果显示分化程度、肿瘤包膜完整性、TNM 分期、微血管侵犯和Spondin-2 均是影响HCC患者术后复发的独立危险因素（P均＜0.05）。见表2。

表2 影响HCC 患者复发的单因素和多因素Cox 回归模型分析

2.4 HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者无瘤生存率的关系

随访结果显示，82 例患者中有39 例（47.56%，39/82）无瘤生存，在14 例Spondin-2 阴性表达者中有12 例无瘤生存，在68 例Spondin-2 阳性表达者中有27 例无瘤生存。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，Spondin-2 阳性表达者的无瘤生存率（39.71%，27/68）低于Spondin-2 阴性表达者（85.71%，12/14），2组的差异有统计学意义（log-rankχ2＝5.355，P＝0.021）。见图1。

图1 HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者无瘤生存率的关系

3 讨论

HCC 细胞的增殖情况能够反映HCC 的生物学特征，且与HCC 根治术的治疗效果密切相关。Spondin-2 是分泌性细胞外基质蛋白F-spondin 家族成员，与神经元的发育、激发自身免疫反应等多种生物学过程密切相关[9]。研究表明，Spondin-2 在胃癌的发生和进展过程中起促癌作用，可作为胃癌诊断的生物标志物[10]。本研究通过免疫组织化学法检测HCC 组织和癌旁组织中Spondin-2 的表达情况，并分析HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者临床病理特征及无瘤生存率的关系，以期为HCC的治疗提供新的思路。

研究表明，与AFP＜400 μg/L 的HCC 患者相比，AFP≥400 μg/L 患者的生存率较低；与TBil＜18 μmol/L 的HCC 患者相比，TBil≥18 μmol/L 患者的肝功能较差[11-12]。因此，本研究中AFP、TBil 分别以400 μg/L、18 μmol/L 为界对患者进行分组。本研究结果显示，HCC 组织中Spondin-2 的阳性表达率显著高于癌旁组织，且低分化、肿瘤包膜不完整、TNM 分期Ⅲ期、有微血管侵犯患者的HCC 组织中Spondin-2 的阳性表达率分别高于中高分化、肿瘤包膜完整、TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期及无微血管侵犯者。这提示HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者的肿瘤分化程度、肿瘤包膜完整性、TNM 分期、有无微血管侵犯等临床病理特征均密切相关。肿瘤的发生和进展是由肿瘤细胞与细胞外基质、肿瘤相关基质细胞、细胞外基质降解酶、细胞因子等肿瘤微环境的相互作用所引起的，其中细胞外基质是肿瘤细胞与微环境相互作用的基础，细胞外基质成分的分布、降解与合成在肿瘤的血管生成及肿瘤细胞的迁移和增殖中发挥着重要作用[13-14]。目前，以细胞外基质作为药物靶点来开发新型药物已逐渐成为临床研究的热点。Spondin-2 包含331 个氨基酸残基，其相对分子质量约为36 000，该蛋白可与细胞外基质结合，介导细胞外基质与细胞间的相互作用，其与适应性免疫反应及固有免疫反应关系密切[15]。研究报道，在甲状腺激素的正向调控下，Spondin-2 参与了胃癌细胞的侵袭和迁移等多种生物学过程[16-17]；此外，Spondin-2 可通过与海马神经元的受体结合而促进胚胎海马神经元的黏附和生长[18]。

本研究结果显示，肿瘤包膜完整性、分化程度、微血管侵犯、TNM 分期和Spondin-2 均是影响HCC 患者术后复发的独立危险因素。既往研究报道，肺腺癌组织中Spondin-2 呈高表达，其表达水平与肿瘤分化程度密切相关，且能够预测患者的无瘤生存情况[19]。本研究的生存分析结果显示，Spondin-2 阳性表达者的无瘤生存率低于Spondin-2阴性表达者，提示HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者预后密切相关，且HCC 组织中Spondin-2 阳性表达表明患者术后复发风险较高。

综上所述，HCC 组织中Spondin-2 的表达与患者临床病理特征及预后密切相关，且Spondin-2 阳性表达者的预后不良风险较高。本研究存在一定的不足之处，如本研究未对HCC 患者的病因进行分类分析，且未探讨Spondin-2 的表达对预后的预测价值，其最佳截断值、诊断效能等尚未明确，后续可进行多中心研究进一步探讨。