FOXM1 和PUM1 在结肠癌组织中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系

沈家生 黄海斌 吴康中

结肠癌是常见的恶性肿瘤，居全球肿瘤相关死亡原因第3 位[1]。尽管结肠癌的治疗已取得了进展，但由于肿瘤易发生复发和转移，患者的5年生存率仍较低[2]。因此，早期诊断和准确预测预后对结肠癌患者的治疗至关重要。叉头盒蛋白M1（FOXM1）是叉头蛋白家族成员，在细胞周期中发挥着关键作用。研究表明FOXM1 蛋白过表达与多种肿瘤的发生和不良预后有关，被认为是一种“原致癌”转录因子和肿瘤标志物[3-4]。哺乳动物Pumilio（PUM）蛋白是序列特异性的RNA 结合蛋白（RBP），具有广泛的作用，其参与了生殖细胞发育[5]。研究发现FOXM1 可作为PUM1 的潜在转录激活因子，参与了睾丸癌进展[6]。目前FOXM1、PUM1 在结肠癌组织中的表达及作用机制尚未明确，本研究探讨了结肠癌组织中FOXM1、PUM1的表达水平及其与患者临床病理特征和预后的关系，以期为结肠癌患者的早期诊断及预后预测提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年1月至2019年6月在湖州市第一人民医院接受手术治疗的135 例结肠癌患者作为研究对象，收集患者的结肠癌组织及癌旁组织（距肿瘤边缘＞5 cm）。纳入标准：（1）患者的诊断符合结肠癌诊断标准[7]，并且经病理检查确诊；（2）首次诊断为结肠癌；（3）手术前未接受放射治疗和化疗治疗。排除标准：（1）合并心血管、肾脏、肝脏疾病；（2）合并严重糖尿病、慢性肺部疾病；（3）有免疫功能、凝血功能障碍；（4）合并其他恶性肿瘤。本研究获得医院医学伦理委员会批准（批件号1611251906），所有受试者及其家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

兔抗人PUM1 多克隆抗体（货号ab265285）、兔抗人FOXM1 多克隆抗体（货号ab180710），均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；DAB 显色试剂盒（货号GK347010），购自基因科技（上海）股份有限公司；RIPA 裂解液，购自上海跃腾生物技术有限公司；Tanon 5200 全自动化学发光成像分析系统，购自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色法检测组织中FOXM1、PUM1 的表达情况 组织标本经石蜡包埋、切片（4 μm 厚）、脱蜡、水合后，加入3% H2O2孵育以阻断内源性过氧化物酶活性。将组织切片分别与兔抗人PUM1、兔抗人FOXM1 多克隆抗体在4 ℃下（稀释比例为1 ∶300）孵育过夜，然后滴加二抗在室温下孵育10 min，用PBS 洗涤3 次。将组织切片加入3,3'-二氨基联苯胺溶液在室温下孵育10 min，然后用苏木精复染，用树脂覆盖。

由2 名病理科医师（副主任医师及以上职称）评估染色强度和染色细胞比例。染色强度评分标准为：未染色记为0 分；弱染色（+）记为1 分；中度染色（++）记为2 分；强染色（+++）记为3 分。染色细胞比例评分标准为：0%记为0 分；1%～25%记为1 分；26%～50%记为2 分；51%～75% 记为3 分；76%～100% 记为4 分。 将染色强度评分与染色细胞比例评分相乘得到总评分（0～12 分）：0～4 分为阴性表达；5～12 分为阳性表达。阳性表达率＝阳性表达例数/总例数×100%。

1.2.2 蛋白质印迹法检测组织中FOXM1、PUM1蛋白表达水平 采用RIPA 裂解液从组织中提取总蛋白。将30 µg 蛋白质样品用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜在室温下用5% BSA 液封闭2 h，然后加入一抗在4 ℃下孵育过夜。采用TBST 缓冲液对膜进行2 次洗脱，将膜加入二抗在37 ℃下孵育2 h。使用ECL 发光液和Tanon 5200 全自动化学发光成像分析系统，分别以GAPDH、β-actin 为内参，采用目的蛋白与内参灰度值之比评估FOXM1、PUM1 蛋白表达水平。实验重复3 次，结果取平均值。

1.3 随访

患者出院后，采用门诊复查或电话询问的方式进行随访，第1、2年每3 个月随访1 次，第3年起每6 个月随访1 次，记录患者的生存时间。随访截至2022年6月或以患者死亡为随访终点。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数资料以例（%）表示，2 组间比较采用卡方检验；计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2 组间比较采用t检验；采用Pearson 相关性分析探讨组织中PUM1 与FOXM1 表达的相关性；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线分析结肠癌组织中FOXM1、PUM1 表达与患者预后的关系；采用多因素Cox回归分析探讨结肠癌患者预后的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织与癌旁组织中FOXM1 和PUM1 的表达情况比较

结果显示结肠癌组织中FOXM1 阳性表达率显著高于癌旁组织[ 74.07%（100/135）比16.30%（22/135）]，PUM1 阳性表达率显著高于癌旁组织[ 82.22%（111/135）比13.33%（18/135）]，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图1、表1。

表1 结肠癌组织与癌旁组织中FOXM1 和PUM1 的表达情况比较/例（%）

图1 结肠癌组织和癌旁组织中FOXM1 和PUM1 的表达情况 免疫组织化学染色 ×200 A 结肠癌组织中FOXM1 表达 B 癌旁组织中FOXM1 表达 C 结肠癌组织中PUM1 表达 D 癌旁组织中PUM1 表达

2.2 结肠癌组织与癌旁组织中FOXM1 和PUM1 蛋白表达水平比较

蛋白质印迹法检测结果显示，结肠癌组织中FOXM1、PUM1 的表达水平均显著高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图2、图3和表2。

表2 结肠癌组织与癌旁组织中PUM1 和FOXM1 蛋白表达水平比较

图2 结肠癌组织和癌旁组织中FOXM1 蛋白表达水平

图3 结肠癌组织和癌旁组织中PUM1 蛋白表达水平

2.3 结肠癌组织中PUM1 与FOXM1 表达的相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，结肠癌组织中PUM1 与FOXM1 表达呈正相关（r＝0.514，P＜0.05）。

2.4 PUM1 和FOXM1 表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系

分析结果显示，结肠癌组织中PUM1 和FOXM1 表达水平与年龄、性别、有无淋巴结转移、肿瘤直径、浸润深度均不相关（P均＞0.05），而与有无远处转移、临床分期、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓均有相关性（P均＜0.05）。见表3。

表3 结肠癌组织中PUM1 和FOXM1 表达水平与患者临床病理特征的关系

2.5 Kaplan-Meier 生存曲线分析

本研究对患者随访3年，有49 例患者死亡，有86 例患者生存，无失访病例，3年总生存率为63.70%。绘制3年Kaplan-Meier 生存曲线，分析结果显示结肠癌组织中FOXM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于FOXM1 阴性表达患者[60.36%（67/111）比79.17%（19/24）]，差异有统计学意义（log-rankχ2＝6.216，P＝0.013）；结肠癌组织中PUM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于PUM1 阴性表达患者[58.00%（58/100）比80.00%（28/35）]，差异有统计学意义（log-rankχ2＝6.688，P＝0.010）。见图4。

图4 Kaplan-Meier 生存曲线分析 A FOXM1 阳性和阴性表达患者的生存曲线 B PUM1 阳性和阴性表达患者的生存曲线

2.6 影响结肠癌患者预后的单因素和多因素分析

单因素分析结果显示，FOXM1、PUM1、远处转移、临床分期及分化程度均与结肠癌患者预后不良均有相关性（P均＜0.05）。多因素Cox 回归分析结果显示，FOXM1、PUM1、远处转移、临床分期及分化程度均是患者预后的独立危险因素（P均＜0.05），见表4。

表4 影响结肠癌患者预后的单因素和多因素分析

3 讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，全球每年约有120 万例新发病例和60 万例死亡病例[8-9]。尽管目前结肠癌的诊断和治疗方面已有了进步，但患者的生存率仍无显著提高[10]。因此，寻找新的结肠癌诊断和预后预测的特异性生物标志物具有重要意义。

PUM 蛋白在机体中调控基因的转录后表达[11]。研究表明PUM1 在多种肿瘤中呈高表达，已知其表达上调与前列腺癌患者生存率降低相关[12]。Yang等[13]的研究发现PUM1 基因表达下调可抑制胰腺导管腺癌进展，低水平的PUM1 mRNA 提示患者的预后良好。Gor 等[14]的研究发现，与常规结肠癌细胞系相比，原发性和转移性结肠癌细胞系中PUM1 mRNA 的表达水平均显著升高。本研究发现结肠癌组织中PUM1 的阳性表达率显著高于癌旁组织（82.22%比13.33%，P＜0.05），结肠癌组织中PUM1表达水平也显著高于癌旁组织（P均＜0.05），这提示PUM1 在结肠组织中发挥了致癌作用。本研究还分析了结肠癌组织中PUM1 表达水平与结肠癌患者临床病理特征的相关性，结果显示其与有无远处转移、临床分期、分化程度及有无脉管癌栓均有相关性，提示结肠癌组织中PUM1 表达水平可反映肿瘤进展程度，其过表达可能会增强结肠癌细胞增殖和侵袭能力。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，结肠癌组织中PUM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于PUM1 阴性表达患者（58.00%比80.00%，log-rankχ2＝6.688，P＝0.010），这提示PUM1 有潜力作为预测患者预后的生物标志物。

FOXM1 是一种转录因子，是多条促癌信号通路的关键调控因子，通过转录激活G2/M 特异性基因网络，在细胞增殖和细胞周期进程中发挥着关键作用[15-16]。研究发现FOXM1 在多种恶性肿瘤（如乳腺癌[17]、卵巢癌[18]、肺癌[19]及结肠癌[20]）中表达上调，其与肿瘤恶性程度高、耐药及患者预后不良有关。本研究发现结肠癌组织中FOXM1 的阳性表达率显著高于癌旁组织（74.07%比16.30%，P＜0.05），结肠癌组织中FOXM1 表达水平也显著高于癌旁组织（P＜0.05），其作用机制可能是FOXM1通过激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路促进结肠癌细胞增殖，从而参与结肠癌的发生和进展。本研究还分析了结肠癌组织中FOXM1 表达水平与结肠癌患者临床病理特征的相关性，结果显示其与有无远处转移、临床分期、分化程度及有无脉管癌栓均有相关性，这提示FOXM1 高表达与肿瘤侵袭和转移密切相关，推测FOXM1 有潜力作为结肠癌治疗的新靶点。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，结肠癌组织中FOXM1 阳性表达患者的3年累积生存率显著低于阴性表达患者（60.36%比79.17%，log-rankχ2＝6.216，P＝0.013），这提示FOXM1 高表达与患者预后不良有关，分析其机制可能是FOXM1 表达升高抑制了结肠癌细胞凋亡，促进了结肠癌进展，从而影响患者的预后。

本研究的Pearson 相关性分析结果显示，结肠癌组织中PUM1 与FOXM1 表达呈正相关 （r＝0.514，P＜0.05），推测两者在结肠癌中可能存在正向调控机制，共同参与了结肠癌的发生和进展，并可影响患者的预后，但具体机制尚需进一步研究揭示。本研究的多因素Cox 回归分析结果显示，FOXM1、PUM1、远处转移、临床分期及分化程度均是患者预后的独立危险因素，这进一步证明了PUM1 和FOXM1 与患者预后不良密切相关，两者均有潜力作为预测结肠癌患者预后的生物标志物。

综上所述，PUM1、FOXM1 在结肠癌组织中表达均显著升高且呈正相关，两者与有无远处转移、临床分期、分化程度及有无脉管癌栓均有相关性，且均是结肠癌患者预后的独立危险因素。结肠癌组织中PUM1 和FOXM1 表达均有潜力作为结肠癌诊断和预测患者预后的生物标志物。