SDC-1 调控TGF-β1/THBS1 信号通路对肝纤维化进程的影响

羊 丹 田婉婷 徐 菁

乙型肝炎是全球范围内的重要公共卫生问题。《2022 中国卫生健康统计年鉴》[1]发布的数据显示，2021年中国新发乙型肝炎97.68 万例，相较于2020年（90.63 万例）增加了8%，距离WHO 提出的2030年消除乙型肝炎的目标仍有一定差距。乙型肝炎是由HBV 感染引起的肝脏疾病，大多数HBV感染者经治疗后在短期内能够痊愈，但5%～10%的成年患者无法清除病毒，可能进展为慢性乙型肝炎[2]。慢性乙型肝炎患者通常无明显症状，但可能引起肝纤维化改变，进而导致肝硬化和肝细胞癌（HCC）发生，威胁患者的生命健康[3]。多配体蛋白聚糖-1（SDC-1）是一种位于细胞表面的糖蛋白，可参与调控细胞黏附、细胞外基质的组装、细胞信号转导、细胞迁移等多种生物学过程。近年来的研究发现，HCC 细胞中SDC-1 表达显著上调，可能发挥促进肝纤维化进展的作用[4]。转化生长因子-β1（TGF-β1）是TGF-β 超家族的多肽成员之一。既往研究表明，肝脏受损后，炎症反应和纤维化的激活可导致TGF-β1 释放，TGF-β1 则可与肝星状细胞（HSC）表面受体结合，激活下游信号转导通路，进而促使HSC 转化为纤维化细胞，参与肝纤维化进程[5]。血小板反应蛋白1（THBS1）属于THBS 家族，在肝脏等组织中表达。Reszegi 等[6]的研究发现，THBS1 与TGF-β1 在肝纤维化进程中存在相互作用，且SDC-1 在此过程中发挥重要的调控作用。目前关于SDC-1 的表达与肝纤维化的关系，以及其对于HSC 及细胞周期作用机制的报道较少。本研究对此进行了分析，旨在为肝纤维化的临床诊治提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2021年4月至2023年4月于三二〇一医院住院治疗并行肝穿刺活体组织病理检查的102 例慢性乙型肝炎患者作为研究对象，其中男性58 例，女性44 例，年龄32～76 岁，平均年龄为（58.35±10.21）岁，BMI 为22～26 kg/m2，平均BMI 为（24.36±2.14）kg/m2；参照《肝纤维化诊断及治疗共识（2019年）》[7]中的肝纤维化分期标准，S0 期22 例，S1 期19 例，S2 期24 例，S3 期21 例，S4 期16 例。纳入标准：（1）18～80 岁；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的诊断标准；（3）尚未接受抗病毒治疗；（4）患者及家属签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他类型的肝炎病毒感染；（2）合并药物性、酒精性、自身免疫性、胆汁淤积性和遗传代谢性等肝病；（3）合并恶性肿瘤；（4）近6 个月内曾接受抗病毒或抗炎保肝治疗；（5）有心、脑、肾等重要器官功能不全。本研究经医院医学伦理委员会审核通过（批件号20210623）。

1.2 方法

1.2.1 血清SDC-1 表达水平检测 采用ELISA 法检测受试者血清SDC-1 的表达水平。于患者入院时，采集清晨空腹状态下的外周静脉血5 mL，3 500 r/min 离心5 min，取上清液，使用全自动生物化学分析仪检测血清SDC-1 的表达水平，试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（货号E-EL-H1298c）。

1.2.2 LX-2 细胞的培养和活化 将人HSC 系LX-2（购自上海雅吉生物科技有限公司）置于10%高糖DMEM 培养基内，于37 ℃、5% CO2环境中培养；待细胞融合度达80%时，弃去培养液，用无菌PBS溶液冲洗；之后更换为无血清DMEM 培养基，将细胞随机分为2 组，其中1 组加入TGF-β1 溶液（质量浓度为10 ng/mL）后继续培养24 h，设为TGF-β1组；另1 组不作处理，设为阴性对照（NC）组。

1.2.3 SDC-1 敲低实验 本研究中的SDC-1 小干扰RNA（siRNA）由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，正向序列为5'-CCACCAAACAGGAGG AAUUTT-3'，反向序列为5'-UUCCUCCUGUUUGGU GGTT-3'。取TGF-β1 组中对数生长期的细胞，以1×106个/孔接种于6 孔板上，加入不含抗生素的DMEM 培养基培养24 h，之后随机分为2 组，其中1 组转染随机排序的小片段siRNA，设为NC siRNA 组；另1 组转染SDC-1 siRNA，设为SDC-1 siRNA 组。以上步骤均按照LipofectamineTM2000转染试剂盒（购自英国Invitrogen 公司）说明书进行操作，之后将细胞置于Opti-MEM 培养基中转染12 h，后更换为无胎牛血清的DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2环境中培养48 h。

1.2.4 α-平滑肌肌动蛋白、SDC-1 和THBS1 蛋白表达水平检测 采用蛋白质印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、SDC-1 和THBS1 蛋白表达水平。取1.2.3 中转染48 h 后的细胞，弃去旧培养基，用预冷的PBS 溶液冲洗3 次；滴加RIPA 裂解液（购自北京伊塔生物科技有限公司，货号SY4680）裂解细胞，冰上反应10～30 min；4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液，使用BCA 蛋白定量试剂盒（购自上海信帆生物科技有限公司，货号YX3763）测定α-SMA、SDC-1 和THBS1 蛋白的表达水平。具体步骤：取蛋白样品进行SDS-PAGE，湿法转至PVDF 膜；用快速封闭液[购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司]封闭抗体，依次滴加兔抗α-SMA 多克隆抗体（购自上海远慕生物科技有限公司）、兔抗SDC-1 多克隆抗体和兔抗THBS1多克隆抗体（均购自上海酶联生物科技有限公司），按1 ∶1 000 比例稀释，4 ℃孵育过夜；用TBST 溶液冲洗3 次，滴加二抗（购自上海烜雅生物科技有限公司），按1 ∶5 000 比例稀释，37 ℃孵育1 h；用TBST 溶液冲洗3 次，采用ECL 法（试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司）曝光显影；使用凝胶成像系统观察条带，应用ImageJ 软件进行灰度值分析，以β-actin 作为内参，实验重复3 次。

1.2.5α-SMA、SDC-1 和THBS1 mRNA 表达水平检测 采用实时荧光定量PCR 法检测α-SMA、SDC-1和THBS1 mRNA 的表达水平。取1.2.3 中转染48 h后的细胞，用PBS 溶液冲洗2 次；滴加TRIzol 试剂（购自南京森贝伽生物科技有限公司）提取总RNA，冰上孵育10 min；用移液枪吹打5 min，转移至EP 管内；滴加预冷的氯仿，4 ℃下12 000 r/min 离心15 min，取上层水相置于新的EP 管内，滴加异丙醇沉淀DNA；4 ℃下12 000 r/min 离心15 min，弃上清，加入预冷的75%乙醇洗涤沉淀；4 ℃下7 500 r/min 离心5 min，弃上清；使用紫外可见分光光度计（购自美国Thermo Fisher Scientific 公司）测定波长260 nm 和280 nm 处的光密度（OD）值，检测RNA 纯度（R），公式：R=OD260/OD280，取R值在1.8～2.0 间的RNA 样品，并测定RNA 浓度；按照反转录试剂盒[购自优利科（上海）生命科学有限公司]说明书操作，将RNA 反转录为cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，引物序列见表1。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；之后94 ℃ 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 60 s，共35 个循环；最后72 ℃延展10 min。取PCR 扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统分析结果；以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算α-SMA、SDC-1 和THBS1 mRNA 的相对表达量。

1.2.6 细胞增殖情况检测 采用CCK-8 法检测细胞增殖情况。取1.2.3 中转染48 h 后的细胞，用胰酶消化细胞，制备细胞悬液；以2×103个/孔接种于96 孔板，在37 ℃、5% CO2环境下培养4 h；待细胞贴壁后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液（购自上海烜雅生物科技有限公司），在37 ℃、5% CO2环境下培养2 h，使用酶标仪（购自美国Thermo Fisher Scientific 公司）测定波长450 nm 处的OD 值，实验重复3 次。

1.2.7 细胞周期检测 采用流式细胞术检测细胞周期。取1.2.3 中转染48 h 后的细胞，用胰酶消化细胞，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；用预冷的PBS 溶液冲洗，加入无水乙醇，4 ℃孵育过夜；1 000 r/min离心5 min，吸出乙醇，用PBS 溶液清洗2～3 次，加入2 μL 的RNA 酶及0.5 mL 的PI 溶液[购自弗元（上海）生物科技有限公司，货号FY600002]，室温避光染色30 min；用300 μm 尼龙网膜过滤，转移至新的含PBS 溶液的EP 管内，使用流式细胞仪（购自美国BD 公司）检测细胞周期。

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以例（%）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝纤维化分期的慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表达水平比较

如表2 所示，随着肝纤维化程度逐渐加重，慢性乙型肝炎患者的血清SDC-1 表达水平呈升高趋势，S4 期高于S3 期，S3 期高于S2 期，S2 期高于S1 期，S1 期高于S0 期，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表2 不同肝纤维化分期的慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表达水平比较

2.2 LX-2 细胞活化鉴定

NC 组中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相对表达量分别为0.67±0.12 和1.13±0.16，TGF-β1 组中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相对表达量分别为2.85±0.56 和3.72±0.61。与NC 组相比，TGF-β1组中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相对表达量均显著升高（P均＜0.05）。

2.3 经TGF-β1 诱导活化的LX-2 细胞中SDC-1 表达水平的变化

NC 组中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相对表达量分别为1.36±0.24 和1.21±0.18，TGF-β1 组中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相对表达量分别为2.63±0.52 和1.89±0.23。与NC 组相比，TGF-β1 组中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相对表达量均显著升高（P均＜0.05）。

2.4 敲低SDC-1 表达对活化LX-2 细胞中α-SMA、TGF-β1 及THBS1 表达水平的影响

NC siRNA 组 中α-SMA、TGF-β1 和THBS1 蛋白的相对表达量分别为2.63±0.59、5.72±1.36 和5.84±1.43，而α-SMA、TGF-β1 和THBS1 mRNA 的相对表达量分别为2.34±0.52、5.43±1.21 和5.67±1.36；SDC-1 siRNA 组中α-SMA、TGF-β1 和THBS1 蛋白的相对表达量分别为1.46±0.37、3.11±1.25 和2.58±1.14，而α-SMA、TGF-β1和THBS1 mRNA 的相对表达量分别为1.53±0.35、2.79±1.28 和2.53±1.34。与NC siRNA 组相比，SDC-1 siRNA 组中α-SMA、TGF-β1、THBS1 蛋白及其mRNA 的相对表达量均显著降低，2 组的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.5 敲低SDC-1 表达对活化LX-2 细胞增殖的影响

如图1 所示，与NC 组相比，TGF-β1 组的细胞增殖活性显著增强（P＜0.05）；与NC siRNA 组相比，SDC-1 siRNA 组的细胞增殖活性显著减弱（P＜0.05）。

图1 敲低SDC-1 表达对活化LX-2 细胞增殖的影响

2.6 敲低SDC-1 表达对活化LX-2 细胞周期的影响

如图2 所示，与NC 组相比，TGF-β1 组中G1期细胞占比显著降低，S 期和G2期细胞占比显著升高（P均＜0.05）；与NC siRNA 组相比，SDC-1 siRNA 组中G1期细胞占比显著升高，S 期和G2期细胞占比显著降低（P均＜0.05）。

3 讨论

研究表明，1990年至2019年中国的乙型肝炎疾病负担虽呈下降趋势，但离2030年消除HBV 的目标仍存在差距，据贝叶斯模型预测，2020年至2030年中国的乙型肝炎的发病患者约为1 486.56万例，死亡患者约为11.18 万例，这提示仍需强化防控措施[9]。肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理特征，在中国肝纤维化主要是由慢性乙型肝炎所致[10]。SDC-1 是一种细胞表面蛋白，参与了细胞-基质的相互作用及信号转导[11]。近年来的研究表明，SDC-1 在肝纤维化的进程中可能发挥着重要作用[5]。研究发现，肝癌细胞表面表达的SDC-1是阻止肝癌细胞迁移的重要因素[12]。因此，探究SDC-1 表达与肝纤维化之间的关系，以及其在肝纤维化进程中的作用机制，对于阻止肝纤维化进展具有重要意义。本研究发现，随着肝纤维化程度逐渐加重，慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表达水平呈升高趋势，这表明慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 表达显著上调，且其与肝纤维化进程相关，其有可能成为评估乙型肝炎患者肝纤维化程度的血清学标志物。

HSC 是肝纤维化进程中的重要角色。正常情况下，HSC 处于静止状态，位于肝小叶之间的腔隙中，当肝脏受到损伤或炎症反应刺激时，HSC可被激活并转化为成纤维细胞样细胞，并通过合成和分泌细胞外基质蛋白，参与肝脏细胞外基质重塑，导致肝组织纤维化及瘢痕形成[13]。因此，抑制HSC 的活化和增殖并诱导其凋亡，是目前抗纤维化治疗的重要策略[14]。TGF-β1 是肝纤维化形成的关键因子[15]。本研究使用TGF-β1 诱导LX-2细胞活化，结果发现与NC 组相比，TGF-β1 组中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相对表达量均显著升高，这符合以往的研究结果[16]。此外，本研究发现，与NC 组相比，TGF-β1 组中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相对表达量均显著升高，进一步证实TGF-β1 在诱导HSC 活化过程中可促使细胞内SDC-1 表达上调，这提示SDC-1 与TGF-β1 可能存在相互作用。基于此，本研究利用siRNA 技术引导内源性核酸酶切割携带互补序列的靶向RNA，结果发现转染SDC-1 siRNA 后，经TGF-β1 诱导的LX-2 细胞中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相对表达量均显著降低，这提示敲低SDC-1 表达可抑制经TGF-β1 诱导的LX-2 细胞活化。肝脏中的THBS1 主要由HSC 合成及分泌[17]。近年来的研究发现，TGF-β1 与THBS1 存在相互作用，THBS1 可通过调节TGF-β1/α-SMA/胶原相关信号通路抑制人心脏成纤维细胞的增殖及胶原合成，进而改善由心脏成纤维细胞中细胞外基质增多所引起的纤维化改变[18]。本研究结果显示，转染SDC-1 siRNA后经TGF-β1 诱导活化的LX-2 细胞中TGF-β1、THBS1 蛋白及其mRNA 的相对表达量均显著降低，这提示敲低SDC-1 表达可抑制TGF-β1/THBS1 信号转导。此外，本研究结果显示，敲低SDC-1 表达后，经TGF-β1 诱导活化的LX-2 细胞的增殖活性显著减弱，G1期细胞占比显著升高，S 期和G2期细胞占比显著降低，这提示敲低SDC-1 表达可抑制HSC 的活化及增殖，阻滞HSC 由G1期进入S 期和G2期。因此，通过干扰SDC-1 表达，可抑制HSC活化并减轻纤维化程度，SDC-1 有望成为抗纤维化治疗的潜在靶点。

综上所述，敲低SDC-1 表达可能通过调控TGF-β1/THBS1 信号通路，抑制HSC 的活化及增殖，阻滞HSC 由G1期进入S 期和G2期，进而发挥抑制肝纤维化进展的作用。SDC-1 与TGF-β1/THBS1信号通路间的调控作用有待今后开展更深入的研究揭示，同时动态监测SDC-1 的表达水平变化也有可能成为评估肝纤维化程度的方法。