环状RNA FN1 在食管癌组织中的表达及预后预测价值

韩晓锐 陈小芳

食管癌是常见的恶性肿瘤，其特点是病死率较高，患者预后较差，5年生存率低于25%[1]。食管癌的常规治疗包括手术、化学治疗和放射治疗，尽管目前食管癌的诊断和治疗已取得较大进展，但患者的预后仍不理想[2]。因此，寻找食管癌的潜在生物靶点从而开发靶向治疗方案具有重要意义。

环状RNA（circRNA）为内源性非编码RNA，其可在真核细胞中表达；circRNA 的特点是具有闭环结构，不易被RNA 酶降解[3]。研究表明，circRNA 通过miRNA 或与RNA 结合蛋白相互作用参与调节蛋白质的表达[4]。在肿瘤组织和细胞系中，circRNA 异常表达可调控肿瘤细胞的恶性表型。circRNA 纤维连接蛋白1（FN1）是来源于FN1 基因的外显子，circRNA FN1（下文简称FN1）是一种高度保守且在恶性肿瘤中呈高表达的circRNA。Song 等[5]的研究发现，FN1 在人食管癌组织中呈高表达，表明其具有致癌作用。胃肠道平滑肌瘤多发生于食管、胃和结肠，Panagopoulos 等[6]采用RNA 测序技术进行检测，发现食管平滑肌瘤组织中FN1 表达水平显著升高，这提示FN1 是胃肠道平滑肌瘤的潜在生物靶点。本研究分析了食管癌组织及癌旁组织中FN1 的表达水平，并探究了食管癌组织中FN1 表达水平对患者预后的预测价值，以期为食管癌的诊断及治疗提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2015年1月至2017年1月在西安国际医学中心医院和西安高新医院接受食管癌切除术的115 例食管癌患者作为研究对象，其中男性65 例，女性50 例，年龄52～78 岁，平均年龄为（65.39±10.22）岁。纳入标准：（1）患者的诊断符合《食管癌规范化诊治指南》[7]中的诊断标准，并经病理组织学确诊为食管癌；（2）临床资料完整；（3）患者为首次确诊食管癌且未接受放射治疗和化学治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）术后曾接受治疗；（3）随访资料不完整。所有患者及家属均签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 FN1 的表达水平检测

收集115 例患者手术切除的食管癌组织及癌旁组织（距肿瘤边缘≥2 cm）。使用TRIzol 试剂（购自美国Invitrogen 公司）提取总RNA，使用Nanodrop 2000 型分光光度计检测总RNA 的浓度和纯度。使用cDNA 反转录试剂盒（购自美国Roche公司）将总RNA 反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR 法检测FN1 的表达水平 （CFX96 型PCR 仪，购自美国Bio-Rad 公司）。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；之后95 ℃变性20 s，60 ℃下退火1 min，72 ℃延伸30 s，共计45 个循环。以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算FN1 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 随访

采用电话询问或门诊复查的方式对入组患者进行为期60 个月的随访，每3 个月随访1～2 次，随访截至2022年1月31 日，或以患者死亡为随访终点。

1.4 统计学分析

应用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法分析FN1 的表达水平与食管癌患者总生存期的关系。采用Cox 回归模型分析影响食管癌患者预后的危险因素。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组织和癌旁组织中FN1 的表达水平比较

实时荧光定量PCR 法检测结果显示，食管癌组织中FN1 的相对表达量为2.88±0.63，显著高于癌旁组织（1.02±0.02），差异有统计学意义（t＝11.293，P＝0.001）。

2.2 食管癌组织中FN1 的表达水平与患者临床病理特征的关系

以食管癌组织中FN1 相对表达量的中位数将患者分为FN1 高表达组（≥1.78，63 例）和FN1 低表达组（＜1.78，52 例）。分析结果显示，FN1 高表达组与FN1 低表达组的性别、年龄、肿瘤浸润深度差异均无统计学意义（P均＞0.05），2 组的淋巴结转移、肿瘤直径、临床分期差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 食管癌组织中FN1 的表达水平与患者临床病理特征的关系/例（%）

2.3 食管癌组织中FN1 的表达水平与患者预后的关系

随访结果显示，FN1 高表达组死亡17 例，累积生存率为73.02%；FN1 低表达组死亡2 例，累积生存率为96.15%，FN1 高表达组的累积生存率显著低于FN1 低表达组，差异有统计学意义（P＝0.047）。见图1。

图1 食管癌组织中FN1 的表达水平与患者预后的关系

2.4 影响食管癌患者预后的单因素分析

单因素Cox 回归模型分析结果显示，食管癌患者的预后与淋巴结转移、肿瘤直径、临床分期及食管癌组织中FN1 的表达水平均有相关性（P均＜0.05）。见表3。

表3 影响食管癌患者预后的单因素分析

2.5 影响食管癌患者预后的多因素分析

多因素Cox 回归模型分析结果显示，淋巴结转移、临床分期及食管癌组织中FN1 的表达水平均为食管癌患者预后的独立危险因素（P均＜0.05）。见表4。

表4 影响食管癌患者预后的多因素分析

3 讨论

食管癌的发病率和病死率均较高，其治疗虽已取得了一定的进展，但疗效仍不理想，因此寻找食管癌的生物标志物对其诊疗及预后预测具有重要意义。circRNA 是由mRNA 反向剪接而产生的共价闭合环，在肿瘤的发生和进展中起着重要的调节作用，可能可以作为恶性肿瘤诊断和预后预测的生物标志物[8]。研究表明，FN1 参与了食管鳞状细胞癌（以下简称为食管鳞癌）的发生和进展，食管鳞癌组织和细胞中FN1 的表达水平均显著升高[9]，这与本研究结果一致。本研究结果显示，食管癌组织中FN1 的相对表达量为2.88±0.63，显著高于癌旁组织（1.02±0.02），差异有统计学意义（t＝11.293，P＝0.001）。FN1 高表达组与FN1 低表达组的性别、年龄、肿瘤浸润深度差异均无统计学意义（P均＞0.05），2 组的淋巴结转移、肿瘤直径、临床分期差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

随着高通量测序技术的发展，circRNA 在生物学领域的应用逐渐受到关注。circRNA 在人体体液（包括血液、唾液、组织液）及组织中呈高表达，是食管癌潜在的生物标志物[10]。研究发现，裸鼠食管癌组织中circRNA B 细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1（BMI1）的表达水平显著升高，提示其可促进移植瘤进展[11]。Niu 等[12]的研究表明，circRNA 可以调控食管癌的发生和进展，对该病的诊断具有重要意义。circRNA 溶血磷脂酸受体3（LPAR3）可以通过促进食管癌细胞的侵袭和迁移，从而促进食管癌进展[13]。研究表明，circRNA 转录因子样5（TCFL5）在食管癌中的表达水平显著升高，并且circRNA TCFL5 可通过miR-543/形成素同源蛋白2（FMNL2）信号通路调控M2 巨噬细胞的极化，促进食管癌进展，提示其可能是食管癌的治疗靶点[14]。

研究表明，FN1 参与了细胞增殖过程中的细胞黏附和迁移，与肿瘤细胞迁移和侵袭密切相关，其参与了甲状腺癌、肾癌、鼻咽癌及食管癌的进展[14]。Cai 等[15]的研究发现，FN1 过表达可促进食管鳞癌的进展，而潜在转化生长因子β 结合蛋白1 （LTBP1）表达下调则可抑制FN1 表达，从而抑制食管鳞癌发生淋巴结转移；此外，FN1 还可抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为，调控上皮间充质转化进程，这提示FN1 可能是食管鳞癌患者的潜在治疗靶点。Li等[16]的研究结果显示，分泌性磷蛋白1（SPP1）和FN1 与食管癌患者的总生存率均呈正相关，并且可能可以预测食管癌复发，该研究表明SPP1 和FN1可能可以作为预测食管癌进展和预后的生物标志物。FN1 可促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其高表达与患者的预后不良有关[17]。研究表明，miR-1 可通过调控FN1 抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭，并促进食管鳞癌细胞凋亡，miR-1/FN1 信号通路可能是食管鳞癌潜在的治疗靶点[18]。食管鳞癌组织中FN1 的高表达与患者的预后不良密切相关，FN1 高表达可促进食管鳞癌细胞发生形态学改变和迁移，从而促进肿瘤转移[19]，这与本研究结果一致。本研究结果表明，FN1 高表达组的累积生存率显著低于FN1 低表达组。多因素Cox 回归模型分析结果显示，淋巴结转移、临床分期及食管癌组织中FN1 表达水平均为食管癌患者预后的独立危险因素。

综上所述，食管癌组织中FN1 表达上调，其为食管癌患者预后的独立危险因素，可作为预测患者预后的生物标志物和潜在治疗靶点。本研究存在一些不足之处：其一，本研究的样本量较小，今后应扩大样本量，进一步验证本文结论；其二，本研究未阐明FN1 在食管癌进展中的调控机制，今后应在本研究基础上进一步探究其作用机制。