谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜生长、脱氨及糖代谢的影响

杨 儒 张 冬 吴璐瑶 胡 兵 陈加成 李 颜 刘立维

(1.华中农业大学水产学院, 华中农业大学鳜鱼研究中心, 长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心, 武汉430070; 2.福建省特种水产配合饲料重点实验(福建天马科技集团股份有限公司), 福清 350308)

谷氨酸(Glu)是一种重要的非必需氨基酸, 它在机体氮代谢中可以被转换成α-酮戊二酸(AKG)[1],这一过程由不同的转氨酶和谷氨酸脱氢酶介导[2]。肠道吸收的谷氨酸有很大一部分被运送到肝脏[3],肝脏将营养物质转化成为可氧化底物(如葡萄糖和脂肪酸)。研究表明, 谷氨酸可以提高金头鲷(Sparus aurata)[4]的生长性能和提高松浦镜鲤(Cyprinus carpio)、杂交鲟等水产动物肝脏的抗氧化能力和蛋白质代谢[5,6]。

α-酮戊二酸也被称作2-氧基戊二酸, 可以在机体内快速转化, 是三羧酸循环的中间体, 可以进行转运和储存氮[7]。谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺等谷氨酸家族氨基酸能经谷氨酸转化为AKG。AKG还能利用谷氨酸产生其他氨基酸, 对氨基酸代谢具有重要的生理功能[8]。相关研究表明AKG可被谷氨酸脱氢酶(GDH)快速氨基转化为谷氨酸, 减少尿素产生和降解毒氮[9,10]。此外添加AKG可以促进松浦镜鲤蛋白质代谢[11]。目前在畜禽方面, 已有AKG添加实验。结果表明, AKG对畜禽的生长、肠道发育和抗氧化方面有积极的促进作用[12—14]。目前来说国内外关于饲料中添加Glu和AKG的研究主要集中在家禽动中, 对肉食性鱼类摄食和氨基酸代谢方面的影响的相关研究却很少。

鳜(Siniperca chuatsi) 是鮨科、鳜属, 为肉食性鱼类, 生性凶猛, 终生以鱼类和其他水生动物为食[15]。作为一种特殊的珍稀淡水鱼类, 其肉质细嫩、口感好、无肌间刺、营养价值高, 在国内外市场上广受欢迎。目前, 国家大力支持提倡绿色健康的水产养殖, 谷氨酸和α-酮戊二酸在饲料中适当添加可以促进鱼类的生长, 增强鱼类对饲料中蛋白质的吸收利用, 在水产养殖中新型饲料研发方面有很大发展潜力。因此本研究初步探讨了谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜生长、食欲及排氨的影响, 推进鳜低氨排放养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验鱼和养殖条件

实验用鱼来自华中农业大学鳜育种创新基地。暂养2周后选择大小均匀、体格健壮、无损伤并摄食活跃具有活力的相同生长阶段的鳜90尾(25±3) g进行实验。将90尾鳜随机分到9个循环系统式圆柱状实验缸(养殖水体体积: 0.3 m3)中, 每个实验缸放养10尾, 其中3个缸1个重复。实验设置3个组, 分别为对照组、Glu组和AKG组(添加量2%[6,16—18])。养殖过程中溶氧维持在7—8 mg/L, 温度19—24℃, pH为7.8—8.1。每日10: 00和17: 00定时定点投喂饲料, 并于14: 00吸粪便换水。前40d按初始体质量的3%定量投喂, 后20d饱食投喂。

1.2 实验饲料

本实验的饲料以鱼粉和酪蛋白为蛋白质源, 鱼油、豆油为脂肪源配制3组等氮(添加量2%, 粗蛋白45.5%)等能的饲料, 饲料配方见表1。饲料原料按表1的添加量由小到大逐一混合均匀, 饲料中的微量添加成分采取逐级稀释法混合均匀。饲料原料粉碎后全部通过60目筛, 按照添加量从小到 大的顺序逐级搅拌混匀, 在添加鱼油和豆油后, 手戴一次性防滑聚乙烯手套, 人工将油脂微小颗粒搓散,将饲料混合均匀。而后根据饲料的分组收入自封袋, 并将饲料放置于-20℃冰箱冷冻保存待用。

表1 实验饲料配方(%干物质)Tab.1 Experimental feed formula (% dry matter)

1.3 样品采集

每天在投喂结束3h后(晚上8:00)在每个实验缸随机取样, 取样3次, 利用纳氏试剂法测量各水体氨氮[19], 采用盐酸奈乙二胺分光光度法测量各水体亚硝酸盐[20]。在养殖结束后,实验鱼禁食24h,使用MS-222麻醉后称重。每缸随机选取约9尾鳜, 擦干称重后于 -4℃保存, 用于实验样本的基本组分的测定。每缸随机抽取9尾鳜, 进行静脉取血, 室温放置1—2h后3000 r/min离心15min, 收集上清, 用于检测血糖含量。然后解剖背部肌肉、肝脏和脑, -80℃保存待测。

1.4 样品分析

血糖和组织中糖原采用南京建成生物工程研究所试剂盒(货号A154-1-1)进行测定。根据GenBank数据库中已公布的鳜序列设计引物, 引物序列见表2,由生工生物工程有限公司合成。用TRIzol (Invitrogen, USA)提取各组织的总RNA, 用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme, 中国)反转录合成第一链cDNA, 反应体系20 μL, 在Light Cycle 480 Ⅱ PCR仪(Roche, Germany)上进行实时荧光定量反应。以鳜rpl13a为内参基因, 参考Su等[21]实验程序, 计算方法参考Livak等[22]。

表2 鳜荧光定量引物序列Tab.2 Real-time primer sequence for Chinese perch

1.5 计算公式

饲料系数(Feed conversion ratio, FCR)=饲料摄食量÷鱼体增重

特定生长率(Specific growth rate, SGR, %)=100×(ln 终末均重-ln 初始均重)÷养殖天数

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100×(终末均重-初始均重)÷初始均重

蛋白质效率比(Protein efficiency ratio, PER)=鱼体增重(g)÷蛋白质摄入量(g)

1.6 数据分析

本实验中所有数据都用平均值±标准误(mean±SE)表示。数据统计分析前, 用SPSS 23.0软件进行单样本t检验(One Samplet-test)剔除偏离总体均值的样本数据。针对鳜同一指标不同摄食模式下的数据比较, 使用单因素方差分析(One-way ANOVA)。针对同一指标下的数据比较, 使用独立样本t检验(Independentt-test)。运用Duncan氏检验法进行多重比较,P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜摄食生长性能的影响

由表3可知, 在饲料中添加Glu和AKG能提高鳜的生长性能。在等量投喂阶段饲料中添加Glu和AKG能显著提高饲料蛋白质效率, 鳜的增重率和特定生长率、显著降低饵料系数(P＜0.05)。在饱食投喂阶段, 饲料中添加Glu和AKG能提高鳜的增重率,显著提高饲料蛋白质效率比和鳜的特定生长率(P＜0.05), 降低饲料的饵料系数。

表3 谷氨酸和 α-酮戊二酸对鳜生长指标的影响Tab.3 Effects of glutamic acid and α-ketoglutarate on growth index of Chinese perch (n=10)

2.2 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜摄食的影响

在饲料中添加Glu和AKG能显著提高鳜日摄食量(图1B)和大脑中促摄食基因npy的相对表达(图1A和1C), 并降低大脑中抑摄食基因pomc的相对表达(图1A和1C;P＜0.05)。其中在等量投喂阶段AKG组大脑中npy的相对表达与对照组相比有显著性差异(图1A;P＜0.05); 在饱食投喂阶段Glu和AKG组大脑中npy、pomc的相对表达与对照组相比均有显著性差异(图1C;P＜0.05)。

图1 摄食相关的基因表达量Fig.1 Expression of genes related to food intake

2.3 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜氨排泄的影响

图2和3显示,在等量投喂阶段, AKG组和Glu组的氨氮和亚硝酸盐含量均低于对照组, 其中AKG组氨氮含量与对照组差异显著(P＜0.05); 在饱食投喂阶段, AKG组和Glu组的氨氮和亚硝酸盐含量均显著高于对照组(P＜0.05)。

图2 等量投喂和饱食投喂阶段实验水体氨氮含量Fig.2 Ammonia nitrogen in the water at the equal feeding stage and satiety feeding stage

图3 等量投喂和饱食投喂阶段实验水体亚硝酸盐含量Fig.3 Nitrite in the water at the equal feeding stage and satiety feeding stage

2.4 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜脱氨相关基因的影响

如图4所示, AKG组和Glu组gdh、ampd相对表达量均高于对照组。其中等量投喂和饱食投喂阶段二者gdh相对表达量与对照组之间均有显著性差异(P＜0.05), 而Glu组与AKG组之间无显著差异。而等量投喂和饱食投喂阶段三者ampd相对表达量差异不显著。

图4 脱氨代谢相关的基因表达量Fig.4 Gene expression related to deamination metabolism

2.5 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜血糖和肝肌糖原的影响

由图5A可知, 饱食投喂阶段, Glu组和AKG组中鳜血清中葡萄糖浓度显著高于对照组(P＜0.05),而Glu组与AKG组之间无显著差异; 图5B显示Glu组和AKG组中鳜肝脏中肝糖原浓度显著低于对照组(P＜0.05), 而Glu组和AKG组无显著差异; 图5C显示Glu组和AKG组中鳜肌肉中肌糖原浓度Glu组和AKG组均低于对照组, 但无显著性差异。

图5 血清中葡萄糖、肝糖原、肌糖原浓度Fig.5 Gene expression related to deamination metabolism

2.6 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜糖异生的影响

如图6所示, Glu组和AKG组鳜肝脏中g6pase基因和pepck基因的相对表达量高于对照组。其中在等量投喂阶段, AKG组鳜肝脏中g6pase基因相对表达量显著高于对照组(P＜0.05; 图6A),pepck基因的相对表达量与对照组相比均无显著性差异(图6A)。在饱食投喂阶段, Glu组和AKG组鳜肝脏中g6pase和pepck基因与对照组有显著性差异(P＜0.05; 图6B)。

图6 糖异生相关的基因表达量Fig.6 Gene expression related to gluconeogenesis

2.7 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜糖酵解的影响

由图7可知, Glu组和AKG组鳜肝脏中gk基因和pk基因的相对表达量均高于对照组。其中在等量投喂阶段, 三者gk和pk基因的相对表达量均无显著性差异。在饱食投喂阶段, Glu组和AKG组鳜肝脏中gk基因和pk基因的相对表达量显著高于对照组(P＜0.05), 二者之间无显著性差异。

图7 糖酵解相关的基因表达量Fig.7 Gene expression related to glycolysis

3 讨论

3.1 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜摄食、生长性能的影响

谷氨酸是肠道肾脏中氨生成的最重要底物之一, 在柠檬酸循环中谷氨酰胺经过谷氨酸转化为α-酮戊二酸。其环化产生的脯氨酸与合成胶原蛋白和结缔组织息息相关[23]。谷氨酸作为谷胱甘肽的前体, 对氧化应激有缓解作用[24]。AKG作为谷氨酰胺的前体, 比谷氨酰胺更便宜、更稳定, 在许多细胞过程中作为抗氧化剂代替谷氨酰胺[25]。并通过三羧酸循环为机体提供能量。在本实验中, 在饲料中添加谷氨酸和AKG显著提高饲料蛋白质效率比、鳜的特定生长率、提高增重率、降低饵料系数, 并促进鳜摄食。这一结果与Caballero-Solares等[4]、Zhelyazkov等[26]研究相似。此外魏玉强等[5]、陈迪[6]的研究也表明α-酮戊二酸可以提高松浦镜鲤、杂交鲟等水产动物肝脏抗氧化、蛋白质代谢等生长性能。其原因可能是AKG参与三羧酸循环, 为机体提供能量并刺激腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化和促进脂肪酸、葡萄糖、氨基酸等物质在肠黏膜的氧化[27,28]。此外, 还有研究中表明, 饲料中添AKG和Glu可以增强松浦镜鲤肠道消化酶活性, 促进肠道发育[18,29]。此外谷氨酸和AKG还能促进肠道生长、发育消化吸 收。Hou等[30,31]研究表明添加1%的AKG能促进猪肠黏膜蛋白质的合成和减轻肠道黏膜的损伤, 同时在一定程度上增加小肠的吸收功能。

在脊椎动物中npy被认为是进中化最保守的神经肽之一, 神经分泌细胞中直接释放, 用于调节饥饿和饱腹感[32]和抵抗饥饿状态[33]。POMC是MSHs和促肾上腺皮质激素(ACTH)及β-内啡肽的前体, 与CART共同调节食欲[34]。根据摄食基因的表达显示, 饲料中Glu和AKG的添加使得npy表达显著提高, 抑摄食基因pomc显著降低。在鳜摄食中促摄食基因的表达主要是摄取营养, 表明Glu和AKG饲料对其生长较为适宜, 这与增重率、特定生长率增加相符。此外本研究还表明, 在等量投喂时, AKG组与谷氨酸组相比,npy表达量更高, 对鳜摄食更有促进作用。

3.2 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜脱氨的影响

鱼类组织中谷氨酸和谷氨酰胺的氧化率高于其他营养物质, 是全身的主要能量来源[35]。谷氨酸主要通过GDH脱氨产生AKG, 进而进入三羧酸循环, 为机体提供大量能量[8,36]。在本研究中, 饲料中添加谷氨酸肝脏中gdh和ampd的表达增加, 这表明谷氨酸在鱼体内进行了脱氨, 促进GDH表达。AMPD参与氨基酸代谢的方式为谷氨酸在转氨酶的作用下, 转氨基至草酰乙酸最终生成天冬氨酸进入嘌呤核苷酸循环, 而天冬氨酸经AMPD的催化反应脱去氨基产生能量[37,38]。进而鱼体内谷氨酸的增加在一定程度上促进了AMPD的表达。AKG具有良好的溶解性, 在水溶液中相对稳定且无毒, 不会增加氮负荷[39]。可通过GDH快速氨基转化为谷氨酸[9,10],并在谷氨酰胺合成酶(GS)作用下转化为谷氨酰胺,减少尿素产生和解毒氮[40]。本实验饲料中添加AKG能促进肝脏中gdh和ampd表达, 且等量投喂下与对照组和谷氨酸组相比, 水体氨氮亚硝酸较低, 对鱼体毒性较小。这表明AKG通过GDH进行了转化,降低了鱼体的毒性和体外氨氮的排放, 这与甄吉福等[41]结论相似。研究表明鱼类摄食量会影响鱼体生长性能和氮排泄率, 在摄食量高时, 氨氮排泄率下降, 蛋白质保留量增加[37]。本实验结果显示, 在饱食投喂阶段, Glu组和AKG组摄食量均高于对照组, 鳜体重增加, 故与等量投喂和对照组相比氨排泄量随之增加, 饲料中添加AKG和Glu已经无法弥补饱食投喂水体氨氮的上升, 从而导致水体氨氮和亚硝酸盐增加。

3.3 饲料中添加谷氨酸和α-酮戊二酸对鳜葡萄糖代谢的影响

血糖是糖代谢的重要指标, 它反映机体的消化吸收能力。机体内的糖类分解可以为机体新陈代谢提供能量。在一定的范围内, 血糖水平的上升表示机体已经摄取了一定营养物质, 可以替代血糖提供能源[42]。实验结果显示, Glu组和AKG组血糖含量显著高于对照组, 说明Glu 和AKG在体内发生反应释放能量, 使机体具有较高的能量可用于生长。在杂交条纹鲈(Plectorhinchus lineatus)和斑马鱼(Danio rerio)[43]及大口黑鲈[44]中研究也表明, Glu、Gln、Asp和Leu的分解代谢共同贡献了肝脏、近端肠、肾脏和骨骼肌中约80%的ATP生成。血液与鱼类生长息息相关, 在流经各组织时, 血液中的葡萄糖能被组织吸收。其中一部分被机体氧化利用, 另一部分则被作为糖原或脂肪储存起来[45,46]。肌糖原可以分解供能, 是肌肉中糖的储存形式[47]。在本实验中饲料中添加Glu和AKG组中肌肉、肝脏中糖原含量较低, 则表明大部分葡萄糖被机体氧化吸收用于生长,少部分转化为糖原和脂肪用于储存。

谷氨酸在鱼体中可以通过GS可逆地转化为谷氨酰胺进而产生AKG, 为机体提供能量[48]。本实验中当饲料中添加Glu和AKG时,g6pase、pepck、gk和pk的基因表达量都高于对照组。这表明, 饲料中添加谷氨酸使鱼体能量充足, 糖异生增加。当机体能量过多时, 机体将会经过肝脏进行糖异生转化为葡萄糖, 肝脏又将葡萄糖释放到血液当中, 这与本实验血糖含量增加相符[49]。糖酵解和糖异生是维持机体糖稳态的两条重要代谢通路[50], 而糖酵解是所有生物体内葡萄糖代谢的唯一途径[51]。当机体糖异生增强时, 为维持体内糖稳定, 进而糖异生越强,gk和pk表达量增加。AKG作为三羧酸循环中一种重要物质, 参与三羧酸循环产生大量ATP, 为机体提供能量[52]。因而饲料中添加AKG时, 体内能量充足, 糖异生增加,g6pase和pepck的基因表达量都高于对照组。此外长期投喂AKG, 糖异生增强, 鱼体为维持体内糖稳定, 进而增加糖酵解, 从而gk和pk表达量增加, 释放能量。从而鱼体内的糖类消化和吸收速率提高, 可以增加糖的能量供应, 减少蛋白质的消耗量, 起到节省蛋白质的作用。

4 结论

在饲料中添加谷氨酸和 α-酮戊二酸, 能够显著促进鳜的摄食, 显著提高增重率和特定生长率, 降低饲料系数, 提高其对蛋白质的利用效率。此外,也能够显著提升脱氨代谢供能水平, 在一定程度上减少鳜的体外氨排泄量。同时, Glu和AKG能促进鳜的糖异生和糖酵解, 促进糖代谢, 能够提高鳜体内蛋白质合成水平, 饲料中氨基酸被更多地用来合成蛋白, 而非分解供能。然而, 谷氨酸和 α-酮戊二酸在饲料中具体的添加比例, 还需进一步研究。