抗大口黑鲈弹状病毒发酵中草药的筛选及其效果评价

曾荣博 刘 爽 张玉军 李 陈 余艳枝 李元平肖运才 刘学芹

(1.华中农业大学水产学院, 农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室, 武汉 430070; 2.湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心, 武汉 430070; 3.湖北华大瑞尔科技有限公司, 武汉 430070; 4.华中农业大学动物医学院, 武汉 430070)

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖鱼类, 又名加州鲈, 黑鲈等。因其肉质鲜美, 无肌间刺, 营养价值高, 深受消费者喜爱, 现已成为我国重要的淡水养殖鱼类之一[1,2]。大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus, MSRV)属于弹状病毒科, 是单股负链RNA病毒, 病毒粒子形态似棒状或子弹状[2]。这种病毒会造成较高的死亡率, 使大口黑养殖行业遭受严重的经济损失。MSRV基因组共有5个开放阅读框(ORFs), 分别编码5种不同结构的蛋白, 分别为磷蛋白(Phosphoprotein, P)、糖蛋白(Glycoprotein, G)、核蛋白(Nuclear protein, N)、RNA聚合酶(RNA polymerase, L)和基质蛋白(Matrixprotein, M), 3′端到5′端的排列顺序为N-P-M-G-L[3]。大口黑鲈弹状病毒病的暴发有很强的季节性, 多发于每年春季的4、5月和秋季的10、11月, 最易感水温为25—28℃, 水温急剧升高或降低时易发。MSRV主要感染2—5 cm的幼鱼, 该病毒传染性强, 致死率高, 1周内死亡率高达90%[4]。MSRV不仅能够通过养殖水体水平传播, 还可以通过繁殖垂直传播[5]。感染MSRV后可导致病鱼鳃部有出血点、体色发黑、体表出血、摄食停止、呈不规则或螺旋游泳状态、身体弯曲、鳍部出现溃烂、拖便等症状。组织病理学观察可发现肝脏呈“花肝”样, 肝、脾、肾肿大、充血; 胃、肠较空, 没有食物[6]。近年来大口黑鲈弹状病毒严重危害大口黑鲈养殖行业。

中草药具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫作用[7]。发酵后的中草药能够提高活性物质的含量, 增强药效; 降低中草药的毒性; 还可以产生新活性成分, 提高中草药的利用率和降低副作用的优势[8], 在我国病害防治方面具有较广阔的应用前景。并因其价格低廉, 作用广泛, 在水产养殖行业也得到应用。发酵中草药可以增强机体抗病能力, 提高机体免疫力, 提高药效和抗病毒作用等。汤菊芬等[9]在对吉富罗非鱼进行免疫保护率测定时, 使用发酵中草药制剂的实验组效果最好, 说明这些中草药对增强罗非鱼的抗病力效果都有非常显著的效果。谢炎福[10]使用发酵中草药后, 鲫存活率明显高于单纯使用复方中草药的对照组, 说明中草药发酵剂对鲫出血性疾病有较好的疗效。由于发酵中草药在抗病毒方面具有良好的效果, 因此近年来发酵中草药得到广泛关注和研究。

病毒性疾病是我国大口黑鲈养殖行业可持续发展的一个重要制约因素, MSRV导致的大口黑鲈弹状病毒病, 病程短, 死亡率高, 对大口黑鲈养殖行业带来了巨大的经济损失。良好的检测方法对病毒性疾病的预防和诊断也至关重要, 张敏琳等[11]基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法, 方便快捷、灵敏度高、特异性高, 具有较大的应用和推广前景。目前针对MSRV,暂无有效的药物治疗和预防。因此本实验基于湖北华大瑞尔公司开发的8种发酵中草药, 筛选出能够对MSRV具有抑制效果的发酵中草药, 在细胞水平、活体水平上进行安全性、有效性验证, 为发酵中草药在水产养殖行业的应用提供理论依据, 为鱼类传染病的防控提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞及毒株

鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini cells, EPC)来源于笔者所在实验室细胞库。MSRV毒株为本实验室分离保存[12]。

1.2 实验试剂

2×TaqPCR Mix、反转录酶、DNA Marker、购自TaKaRa公司; M199细胞基础培养液购自Hyclone; 胎牛血清(FBS)购自Gibco公司; MTT试剂盒购自碧云天公司; 2×SYBR 购自爱博泰克生物有限公司;SteadyPureVirus病毒DNA/RNA提取试剂盒购自艾科瑞生物公司。

1.3 引物序列

本研究所用引物序列见表1。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 发酵中草药来源、成分及有效物质的提取

8种发酵中草药由湖北华大瑞尔有限公司提供,名称依次为L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS(表2)。发酵中草药是使用1—2 cm的中药材, 将其混合物浸入50%水分的水中, 加热至80℃ 1h, 然后冷却至37℃。发酵菌种使用枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌进行联合发酵, 将3种益生菌按不同比例加入加工后的中草药混合物中, 发酵72h,干燥, 粉碎而成。

表2 八种发酵中草药成分信息Tab.2 Ingredient information for 8 fermented Chinese herbs medicine

称取5 g发酵中草药置于烧杯中, 加入100 mL纯净水, 温度设置为100℃, 放置恒温磁力搅拌器上进行熬制。熬制挥发至50 mL (浓度为100 mg/mL)时, 冷却后使用0.22 μm滤器过滤, 过滤后分装保存。

1.5 发酵中草药对细胞的毒性检测

将不同浓度的发酵中草药加入96孔板中, 孵育24h后使用MTT法, 同时设置调零孔(培养基、MTT和MTT溶解液), 对照孔(细胞、培养液、MTT和MTT溶解液), 酶标仪在570 nm测定吸光度。

1.6 抗MSRV的发酵中草药的筛选

使用0.1 MOI接毒剂量感染EPC细胞, 置于28℃培养箱中1h, 在5%维持培养基中加入40 μL发酵中草药药液, 离心混匀后加入细胞孔中, 24h后用TRIzol收集细胞孔中贴壁细胞, 提取细胞RNA, 而后反转录为cDNA, 使用qRT-PCR法检测抗病毒效果。qRT-PCR反应程序: 95℃ 3min; 94℃ 25s; 55℃25s; 72℃ 15s, 35个循环; 72℃ 10min。

1.7 发酵中草药在细胞水平上的抗MSRV效果

在安全浓度范围内, 选用不同浓度梯度的药物探究药物浓度对抗病毒效果的影响。分别设置攻毒组, 预防组, 共育组, 治疗组。

(1)攻毒组: 用0.1 MOI MSRV缓慢加入细胞孔中, 置于28℃培养箱中, 并在1h后更换5%维持培养基。

(2)预防组: 取3个1.5 mL EP管, 每管加入1 mL MEM基础培养基, 依次加入20、40和80 μL熬制后的发酵中草药药液, 即终浓度为2、4 和8 mg/mL,短暂离心并混匀后缓慢加入细胞孔中, 置于28℃培养箱中, 4h后弃去培养基, 缓慢加入0.1 MOI MSRV,并在1h后更换5%维持培养基。

(3)共育组: 取3个1.5 mL EP管, 每管加入0.1 MOI MSRV, 依次加入20、40和80 μL熬制后的发酵中草药药液, 即终浓度为2、4 和8 mg/mL, 短暂离心并混匀后缓慢加入细胞孔中, 置于28℃培养箱中, 并在1h后更换添加5%血清的维持培养基。

(4)治疗组: 将3个细胞孔中缓慢加入0.1 MOI MSRV, 置于28℃培养箱中, 并在1h后弃去病毒液。取3个1.5 mL EP管, 每管加入1 mL添加5%血清的维持培养基, 依次加入20、40 和80 μL熬制后的发酵中草药药液, 即终浓度为2、4 和8 mg/mL,短暂离心并混匀。

24h后收集细胞上清, 冻存于-80℃冰箱, 用于空斑实验。每孔用1 mL TRIzol将贴壁细胞缓慢吹打下来, 吸出后放入2 mL EP管中。用TRIzol法提取RNA后并进行反转录为cDNA, 使用qRT-PCR法检测抗病毒效果。

1.8 空斑实验(Plaque assay)

本实验使用空斑实验检测病毒滴度, 实验步骤: (1)将细胞接种到24孔板中, 待单层细胞长至100%用于病毒感染; (2)无血清培养基洗涤细胞两次, 每个样品取5个2 mL EP管, 每管中加入1800 μL基础培养基, 在第一管中加入200 μL样品, 震荡混匀吸取200 μL后加入第2个EP管中, 以此类推, 10倍梯度稀释病毒。在24孔板中每孔加入500 μL的病毒液, 每个浓度做3次重复, 置于28℃培养箱孵育1h; (3)用无血清培养基清洗1次, 加入1 mL含有甲基纤维素半固体培养基; (4) 28℃培养箱继续培养60—72h, 待形成肉眼可见空斑后用10%的甲醛固定12h, 自来水冲洗干净; (5)倒扣在吸水纸上晾干,加结晶紫染色液染色3h, 自来水冲洗干净后晾干,计算读数。

1.9 大口黑鲈携带病毒检测

大口黑鲈28℃暂养7d后, 随机取3条, 匀浆后混匀。使用DNA/RNA提取试剂盒进行RNA/DNA提取。采用特异性引物进行PCR检测有无携带病毒。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.10 发酵中草药对鱼体的毒性实验

大口黑鲈28℃暂养7d后, 取50条分为5个组, 沿胸鳍基部注射0、5、20、100和1000 μg (体积为10 μL)发酵中草药药液, 记录死亡率。

1.11 发酵中草药在鱼体水平抗MSRV效果检测及效果评定

大口黑鲈28℃暂养7d后, 取150条分为5个组做不同处理, 分别为药物组、对照组、攻毒组、预防组、治疗组。

药物组: 沿胸鳍基部注射10 μL发酵中草药药液, 注射30条;

对照组: 沿胸鳍基部注射10 μL MEM基础培养基, 注射30条;

预防组: 沿胸鳍基部注射10 μL的发酵中草药药液, 36h后, 将107PFU的MSRV用MEM基础培养基稀释10倍后, 沿胸鳍基部注射10 μL;

治疗组: 将107PFU的MSRV使用发酵中草药药液稀释10倍后, 沿胸鳍基部注射10 μL;

攻毒组: 使用MEM基础培养基将107PFU的MSRV稀释10倍后, 沿胸鳍基部注射10 μL。观察10d, 记录死亡率和存活率。并同时设置取样组, 取大口黑鲈肝脏组织和脾脏组织, 做HE染色病理切片及组织病毒载量检测。用TRIzol法提取RNA后并进行反转录为cDNA。通过qRT-PCR的方法检测MSRV-G基因的水平, 来检测X1药物不同浓度不同处理方式抗MSRV的能力。

1.12 组织病理学观察

分别取鱼的肝、脾组织, 4%多聚甲醛固定24h,各组织分别经70%、80%、95%和100%乙醇脱水,二甲苯透明、石蜡包埋切片(5—7 μm)、HE染色,最后在显微镜下观察、拍照。

2 结果

2.1 MTT法检测发酵中草药对细胞的毒性

通过MTT法检测发酵中草药(L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS)对细胞的毒性, 结果表明发酵 中 草药L1、L2、L3、X1、X2和ZHS未对EPC细胞造成明显的损伤和毒性, 细胞存活率无显著差异。中草药L4和L5在4 mg/mL时对细胞造成损害, L4处理后细胞存活率下降约50%, L5处理后细胞存活率下降80%。此外, 中草药X1和X2表现出促进EPC细胞生长的作用(图1)。

图1 八种发酵中草药对 EPC细胞的毒性检测Fig.1 The toxicity of eight kinds of fermented Chinese herbal medicines to EPC cells

2.2 抗MSRV的发酵中草药筛选

MSRV感染EPC细胞后, 在12孔板中加入8种中草药, 24h后收取细胞样。根据qRT-PCR检测结果表明, 8种发酵中草药对MSRV都有明显的抗病毒效果, 能够显著抑制MSRV的感染, 其中X1效果最好(图2), 因此选X1药物进行后续的效果评价实验。

图2 八种发酵中草药抗MSRV的效果筛选Fig.2 Screening of the anti-MSRV effects of eight fermented Chinese herbal medicines

2.3 X1药物在细胞水平上的抗MSRV效果

使用不同方式进行处理EPC细胞后, 24h后收取细胞样。qRT-PCR检测结果表明X1药物3种处理方式对MSRV都有明显的抗病毒效果, 且治疗组效果最为明显, 其次为预防组和共育组。其中在治疗组和共育组, X1药物表现出其抗病毒效果与药物浓度呈正相关关系(图3A—C)。

图3 发酵中草药X1在细胞水平上的抗MSRV效果Fig.3 Anti-MSRV effect of fermented Chinese herbal medicine X1 at the cellular level

收集细胞病毒上清, 通过空斑实验检测X1药物抗MSRV的能力。空斑实验结果表明经过X1药物处理后, 预防组、共育组和治疗组都使MSRV的病毒滴度降低10倍左右。其中共育组和治疗组抗病毒效果与药物浓度呈正相关关系, 浓度为8 mg/mL时效果最好。预防组在浓度为4 mg/mL时效果最为显著(图3D—G)。

2.4 大口黑鲈携带病毒检测

为检测大口黑鲈是否携带其他病毒, 针对大口黑鲈易携带的病毒(LMBV、ISKNV、MSRV和NNV)进行检测。通过PCR基因扩增琼脂糖凝胶电泳后,未看到特异性条带, 证明大口黑鲈未携带LMBV、ISKNV、MSRV和NNV。

2.5 发酵中草药对鱼体的毒性实验

大口黑鲈胸鳍基部注射10 μL药物浓度为0、0.5、2、10和100 mg/mL的发酵中草药液, 统计死亡率。根据实验结果表明发酵中草药未对鱼体造成伤害及死亡, 存活率100% (表3)。

表3 大口黑鲈存活率Tab.3 Survival rate of largemouth bass

2.6 X1药物在鱼体水平抗MSRV存活率检测

设置不同处理方式, 进行大口黑鲈存活率检测。分别为空白对照组、攻毒组、预防组、治疗组、药物对照组。处理后观察7d, 记录每天的死亡率。结果表明, 攻毒组在第2天出现大量死亡, 第4天时全部死亡, 存活率为0; 预防组和治疗组均能提高大口黑鲈存活率, 预防组存活率提高10%, 治疗组存活率提升20%, 治疗组效果优于预防组(图4)。

图4 大口黑鲈存活率检测Fig.4 Results of largemouth bass survival assay

2.7 X1 药物对大口黑鲈肝脏、脾脏组织病毒载量作用的结果

根据大口黑鲈不同组织病毒载量检测结果表明, 第1天在肝脏组织中, 预防组和治疗组对MSRV的增殖有明显抑制效果; 在脾脏组织中, 预防组与攻毒组相比差异不显著; 治疗组对MSRV具有明显的抑制效果。第3天在肝脏组织中, 预防组和治疗组与攻毒组相比都具有明显差异; 在脾脏组织中,预防组和攻毒组病毒载量差异不显著, 治疗组具有显著差异。综上结果, X1对MSRV具有良好的抗病毒作用(图5)。

图5 大口黑鲈组织病毒载量测定Fig.5 Measurement of tissue viral load in largemouth bass

2.8 组织病理学观察

大口黑鲈肝脏组织切片观察发现对照组肝脏组织结构正常, 肝索、肝细胞排列紧密; 肝窦未见扩张。治疗组未见明显变化; 预防组少量肝细胞轻度水肿; 攻毒组视野内大量肝细胞轻度水肿, 细胞肿胀, 胞浆淡染, 可见大量圆形空泡, 肝实质内可见炎症细胞浸润(图6)。

图6 大口黑鲈肝脏组织切片Fig.6 Liver tissue sections of largemouth bass

大口黑鲈脾脏组织切片观察发现, 预防组和治疗组与对照组相比未见明显异常, 脾组织结构正常。攻毒组脾组织结构异常, 视野内脾组织明显水肿, 部分细胞呈空泡样变性, 组织间隙增大, 红髓内小淋巴细胞数量明显减少(图7)。

3 讨论

水产养殖病害已严重影响了我国水产养殖业的健康可持续发展, 并且病毒性传染病对水产养殖行业危害巨大, 其传播速度快, 能够造成鱼体大量死亡。大口黑鲈肉质鲜美, 营养价值高, 经济价值高, 属于名特优鱼类。然而大口黑鲈养殖业受到病毒的威胁, 其中大口黑鲈弹状病毒主要感染大口黑鲈幼鱼导致较高的死亡率, 是大口黑鲈主要的病原。近年来MSRV对水产养殖行业带来的危害逐年递增, 我国多地报道了MSRV感染事件, 给大口黑鲈养殖行业带来了一定的经济损失。目前针对该病毒无有效的商品化治疗手段, 对MSRV的防治以疫苗和药物开发为主要方向。大口黑鲈弹状病毒疫苗已经有减毒活疫苗及亚单位疫苗的相关研究, 使用疫苗后可以提高非特异性免疫水平和特异性的抗体水平, 在实验室水平下都有可观的保护率[13—16]。但是MSRV的主要感染对象是幼鱼, 没有成熟的免疫系统, 接种疫苗后很难产生较强的免疫应答, 疫苗的商品化应用存在一定难度。鉴于此, 针对MSRV的药物开发是一种更有效的治疗手段, 有研究发现多种天然植物提取物及合成的化合物具备作为治疗MSRV药物的潜力。张雨[17]筛选出3种对MSRV具有明显抑制效果的化合物, 分别为鸟嘌呤核苷、阿糖腺苷、牛蒡子苷元。对MSRV的抑制率分别为95.77%、83.3%和54.73%。Yang等[18]研究结果表明利巴韦林对MSRV也具有良好的抗病毒效果,能够抑制MSRV感染的CPE和核损伤, 这一发现可为水产养殖抗MSRV药物的发现和开发提供参考。杭小英等[1]选择了8种中草药(板蓝根、黄芪多糖、白花蛇舌草、金银花、黄藤素、葡萄糖酸锌、白芍及连翘)进行体外抗病毒实验, 结果表明,黄芪多糖、白芍、金银花等对MSRV都有良好的抗病毒效果。中草药是中国特有的技术, 已经从中草药中发现大量有效的药物, 由于其低耐药性、低毒性, 从中草药中开发治疗MSRV的药物也是有效的尝试。

3.1 发酵中草药X1显著抑制MSRV感染

本研究中筛选出发酵中草药X1, 在细胞水平上和鱼体水平上对MSRV有较好的抗病毒效果, 其成分为鱼腥草、板蓝根、南芪和杏仁。有研究表明,鱼腥草水提物通过阻断NF-κB的激活来阻断单纯疱疹病毒2型的感染, 从而发挥抗病毒效果[19]; 而鱼腥草挥发油提取物对1型疱疹病毒具有良好的抗病毒效果; 并且鱼腥草挥发油在发挥其抗病毒效果时, 对细胞无毒性[20]。此外, 鱼腥草对其他病毒(EV71、DENV-2、NDV、ZIKV等)也具有良好的抗病毒效果。板蓝根的主要成分为板蓝根多糖, 板蓝根多糖能够直接作用8种流感病毒和杀灭猪伪狂犬病毒及猪流感病毒H3N2[21]。南芪和杏仁研究相对较少, 南芪具有提高抗应激能力, 增强免疫功能和补血作用[22]。杏仁具有抗炎, 抗肿瘤, 免疫调节等药理作用[23]。因此, 在X1复方发酵中草药中, 可能是鱼腥草和板蓝根主要发挥了抗病毒作用, 南芪和杏仁可能发挥了抗应激、抗炎等功能。

本研究表明X1发酵中草药对MSRV具有良好的抗病毒效果, 在细胞水平上的实验结果能够表明X1能够显著抑制MSRV感染, 在鱼体水平上对大口黑鲈的存活率提高了20%。相关研究表明, 厚朴酚及其衍生物在浓度为40 mg/kg时将大口黑鲈的存活率提高了72%; 几种香豆素类化合物在体外也具有显著的抗SVCV效果, 但是在体内的抗病毒效果也并不显著, 导致这一原因可能是由于药物在鱼体内代谢过快或是药物利用率低等。因此本研究推测是由于药物浓度低, 鱼体代谢快, 利用率较低等导致在鱼体上抗病毒效果不佳。后续可具体探究发挥其抗病毒效果的有效成分, 对有效成分进行提取或合成化合物, 在实际应用中发挥作用。

3.2 发酵中草药的给药方式

本研究使用鱼体注射的方式, 注射具有吸收快,药物直接进入体内发挥作用等优点。研究表明腹腔注射8-羟基喹啉及熊果酸都可以分别提高15%和12.5%的鲈感染MSRV的相对存活率[24,25]。所以我们首先使用了注射的方式评价X1发酵中草药对MSRV感染大口黑鲈的影响。未探究与口服、浸泡等其他使用方式之间的差异。某些中草药使用浸泡、泼洒、口服等方式也可以发挥较好的效果。在水产养殖行业的实际应用上, 注射的给药方式成本高, 操作不便, 且注射方式可能会对幼鱼产生应激, 且会对鱼体产生机械性损伤, 从而会导致幼鱼存活率降低。因此, 注射产生的效果与口服给药的效果在差异不显著的情况下, 口服给药的方式更具有操作简便、可行性强、成本低的优势。不同的提取方式带来的效果也可能存在差异, 应根据中草药在实际应用时来选定最适合最有效的使用方法。在后续的研究中, X1发酵中草药的口服给药、浸泡给药等其他使用方式也是值得进一步探究的。

本研究筛选出对MSRV具有良好抗病毒效果的中草药, 并从体外实验和鱼体实验评定其抗病毒效果, 这为中草药及发酵中草药在水产养殖中的防控应用提供参考依据, 为中草药抗水产病毒性疾病及将来开发抗病毒药物具有重大意义。