气相色谱-质谱联用仪测定柑橘类水果中2,4-滴的残留量

陈丽香， 许佩勤

（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；3.广东省食品质量监督检验站，广东 广州 511442）

2,4-滴，化学名称为2,4-二氯苯氧乙酸，是一种有机化合物，主要用作除草剂和植物生长调节剂，也可作为杀菌保鲜剂，常在柑橘、番茄、香蕉等果蔬种植中用于防落花落果和延长贮藏保鲜时间[1-2]。世界卫生组织国际癌症研究机构在2017年10月27日公布的致癌物清单中，2,4-滴为2B类致癌物，对人类有潜在致癌作用。有研究认为，长期暴露超过最大污染水平，2,4-滴可能会对肾脏和肝脏等造成损害，甚至能够导致畸致癌变[3]。

《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》GB 2763-2021规定了2,4-滴和2,4-滴钠盐在柑、橘、橙的最大残留限量为0.1 mg/kg，指定按照GB/T 5009.175规定的方法测定，该方法采用气相色谱仪配置电子捕获检测器（ECD）检测，ECD灵敏度高，农产品样品基质复杂，杂峰干扰多，定性能力较弱，检出阳性需要再用质谱辅助定性。目前相关文献报道2,4-滴的检测方法主要有气相色谱法[4-5]、气相色谱质谱法[6-7]、液相色谱法[8-9]、液相色谱串联质谱法[10-11]和离子色谱法[12]，多数是研究饮用水中2,4-滴的检测方法，没有专门研究柑橘类样品中2,4-滴的检测方法。2,4-滴因其具有极性官能团，使得其用气相色谱分析会有拖尾和吸附现象，为改善其色谱行为，需通过衍生化反应来封闭羟基的氢键部位，改善它与固定性相的作用特性。衍生化常用反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷化和离子化等，GB/T 5009.175-2003标准方法采用酯化，用14%三氟化硼丁醇溶液将2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，该方法用的衍生剂比较难购得且价格较贵。本文研究在酸性条件下采用乙醚提取，硫酸作为催化剂用正丁醇将2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，使用气相色谱-质谱联用仪测定柑橘中2,4-滴的残留量，外标法定量，建立柑橘水果中2,4-滴测定的方法，优化后的方法灵敏度高，定性准确，回收率稳定，能更好地监测柑橘类水果中2,4-滴的残留量，为食品安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沃柑为市售。

2,4-滴标准物质纯度为99.4%，上海安谱璀世标准技术服务有限公司；甲醇，色谱纯，上海星可高纯试剂有限公司；无水乙醚，分析纯，广州化学试剂厂；正己烷，色谱纯，上海星可高纯试剂有限公司；丙酮，色谱纯，广州化学试剂厂；正丁醇，分析纯，天津康科德技术有限公司；浓硫酸，分析纯，广州化学试剂厂；氯化钠，分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司；实验用水为Milli-Q-Advantage A10制备的一级水，美国Milli-pore公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪，Agilent GC 7890B，MSD 5977B，配拉出透镜高灵敏度离子源（EI），美国安捷伦公司；MS 3basic 旋涡混合器，德国IKA 公司；ROTINA 380R 高速冷冻离心机，Hettich 公司；TL-DCII 氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；HWS-26水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

1.3.1.1 标准储备液的配制：准确称取2,4-滴标准物质10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 000 µg/mL的标准储备液，冷冻保存。

1.3.1.2 标准中间液的配制：准确移取标准储备液（1.3.1.1）100 µL，用甲醇稀释并定容至100 mL，即得1.00 µg/mL的标准中间液，冷藏保存。

1.3.1.3 标准曲线工作溶液的配制：分别准确移取2,4-滴标准中间液（1.3.1.2）0、5.00、10.0、50.0、100、200、500 µL，用甲醇稀释定容至1 mL，氮吹至干，以下步骤按1.3.2.2与试样同时处理，最终得0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 µg/mL的系列标准工作液。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取 称取样品5.00 g置于50 mL离心管，加入5 mL pH 2.0的酸性稀硫酸水溶液，再加入10 mL乙醚，振荡提取5 min，8 500 r/min离心3 min，将有机相转移到另一支50 mL离心管中，于残渣中加入10 mL乙醚，重复提取一次，合并有机相，加入2 g无水硫酸钠，混匀以吸收水分，放置5 min后转移到另一条50 mL离心管，用少许乙醚润洗无水硫酸钠2次，合并，室温氮吹至干，待衍生化。

1.3.2.2 衍生化 加入160 µL 正丁醇和40 µL 浓硫酸，加盖混匀后在45 ℃下衍生50 min，加入2.5 mL 正己烷:丙酮（9+1），涡旋3 min，8 500 r/min离心3 min，将上清液转移到另一条15 mL塑料离心管中，加3 mL 50 g/L饱和氯化钠水溶液,涡旋1 min，8 500 r/min 离心3 min，移出有机相，加入约0.3 g无水硫酸钠进行干燥，将溶剂转移至进样小瓶中，供气相色谱-质谱联用仪测定。

1.3.3 仪器分析参数

1.3.3.1 色谱条件 色谱柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；升温程序：50 ℃保持1 min；以10 ℃/min升至230 ℃，再以30 ℃/min升至260 ℃保持5 min；进样口温度：260 ℃；载气（He）流速：1.2 mL/min；进样模式：不分流进样；进样量：1 µL。

1.3.3.2 质谱条件 拉出透镜高灵敏度离子源（EI）；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质谱接口温度：260 ℃；采集模式：选择离子扫描（SIM）；溶剂延迟：10 min；定量离子：276；定性离子：185、278。

1.3.4 数据处理

2,4-滴衍生后标准工作液和试样衍生后溶液通过气相色谱-质谱联用仪进行测试，应用安捷伦Mass-Hunter数据处理软件对数据进行分析处理，以2,4-滴衍生物峰面积为纵坐标（Y），以2,4-滴的浓度为横坐标（X，mg/L），绘制标准曲线，根据标准曲线计算得到试样溶剂中2,4-滴的浓度（mg/L），如果试样溶液中2,4-滴的浓度超出线性范围时应根据测定浓度进行适当稀释后再进行分析。同一试样进行平行试验测定，平行试验测定结果的算术平均值为最终测定结果。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

考察了2,4-滴衍生物在农残分析常用的弱极性（TG-5MS）和中极性（DB-1701P）色谱柱上的色谱行为。根据1.3.3仪器分析条件，分析为0.1 mg/kg的2,4-滴衍生物在上述两种极性色谱柱的出峰情况，总离子流色谱图如图1所示。结果表明：2,4-滴衍生物在这两种色谱柱上峰形尖锐对称，但弱极性色谱柱的灵敏度比中级性的灵敏度高，中级性色谱柱的杂峰也比较多，故选用弱极性色谱柱进行分析。

图1 2,4-滴衍生物在弱极性色谱柱（TG-5MS）和中极性色谱柱（DB-1701P）的色谱图Figure 1 Chromatograms of 2,4-D derivatives with weakly polar (TG-5MS) column and medium polarity (DB-1701P) column

2.2 质谱条件的优化

采用全扫描（SCAN）的采集模式对2,4-滴衍生物（2,4-滴丁酯）进行分析，质谱图如图2 所示。质荷比丰度由高到低分别是185、57、276、175、161、278，选择这几个质荷比作为特征离子分析沃柑加标样品，发现57、175 和161 目标峰附近有干扰峰，且不能完全分离，185基线有点漂移，276基线平整且目标峰附近没有杂峰干扰。根据选择质荷比大、丰度高及无干扰的原则，最后确定了276作为定量离子，185、278作为定性离子。加标样品的定量离子和定性离子色谱图见图3。

图2 2,4-滴衍生物全扫描质谱图Figure 2 Full scan mass spectrum of 2,4-D derivatives

图3 加标样品定量离子和定性离子色谱图Figure 3 Spiked sample quantifier and qualifier chromatograms

2.3 提取次数的确定

在空白沃柑样品中加入0.1 mg/kg 的2,4-滴标准溶液，除了用乙醚提取次数不一样，其他步骤按照1.3.2 操作，对比提取1 次、2 次和3 次对加标样品回收率的影响，每次用10 mL 乙醚提取。比对结果见表1。结果表明，提取1 次回收率偏低，提取2 次和3 次的回收率相差不大，综合考虑提取效率、实验时间和成本节省，确定本方法提取次数为2 次。

表1 不同提取次数对回收率的影响Table 1 Effect of different extraction times on the recovery rate

2.4 衍生条件的优化

2.4.1 衍生温度的确定

配制5个浓度为0.2 µg/mL的标准溶液，氮吹干后，加入160 µL正丁醇和40 µL浓硫酸，在35、45、55、65、75 ℃ 5个不同温度下各衍生40 min，之后操作同1.3.2.2，比较结果见图4(a)。结果表明，45 ℃条件下衍生时目标物的响应值最大，故确定45 ℃为衍生温度。

图4 不同衍生温度和衍生时间对2,4-滴衍生物响应值的影响Figure 4 Effect of different derivation temperatures and times on the response value of 2,4-D derivatives

2.4.2 衍生时间的确定

配制5个浓度为0.2 µg/mL的标准溶液，氮吹干后，加入160 µL正丁醇和40 µL浓硫酸，在45 ℃下分别衍生30、40、50、60、70 min，之后操作同1.3.2.2，比较结果见图4（b）。结果表明，衍生50 min时目标物的响应值最大，故确定衍生时间为50 min。

2.5 标准曲线、检出限和定量限

按确定的方法进行测定，以定量离子的峰面积为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X，µg/mL），绘制标准曲线，如图5 所示。结果表明，在0 ～ 0.5 µg/mL 的线性范围内，2,4-滴衍生物呈良好线性关系，相关系数（R2）大于0.999。根据3 倍和10 倍定量离子信噪比确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），得出2,4-滴的检出限为0.002 5 mg/kg，定量限为0.005 mg/kg，可以满足柑橘中2,4-滴检测要求。

图5 2,4-滴的标准曲线图Figure 5 2,4-D Standard curve

2.6 准确度和精密度

在不含2,4-滴的沃柑空白试样中分别添加0.005、0.01 和0.1mg/kg 3 个水平做加标回收试验，每个水平做6 个平行，按照“1.3”实验方法进行试验，结果见表2。结果表明，2,4-滴的回收率在86.61%～99.32%之间，RSD 在2.08%～4.46%（n= 6）之间，符合GB/T 27404-2008附录F中回收率和精密度的要求。

表2 2,4-滴在沃柑中的添加回收率和相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 2, 4-D added to citrus

2.7 实际样品检测

按照本文建立的方法对市售的30 批柑橘样品进行检测，检测结果见表3。30批柑橘样品中共有17批样品检出2,4-滴，检出率高达56.7%，其中有6 批样品的含量高于食品安全国家标准GB 2763-2021 中柑橘的最大残留限量0.1 mg/kg，不合格率为20%。

表3 实际样品中2,4-滴的检测结果Table 3 Detected results of the 2,4-D in real sample

3 结论

本文在酸性条件下采用乙醚提取，硫酸作为催化剂用正丁醇将2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，利用气相色谱-质谱联用仪测定柑橘中2,4-滴的残留量。该方法回收率范围在86.61%～99.32%之间，相对标准偏差在2.08%～4.46%（n= 6）之间，检出限为0.002 5 mg/kg，定量限为0.005 mg/kg，符合分析方法的要求，灵敏度高，回收率稳定，能够满足柑橘类水果中2,4-滴的定性和定量检测，为食品安全监督管理提供准确的数据。