基于网络药理学和分子对接技术探讨丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制

陈阳 ，刘剑 ，陆翔 ，陆瑞敏

1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

糖尿病微血管并发症包括肾脏病变和眼底病变，其中肾脏病变即为糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN），可促使慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病的发生发展。如不及时治疗，CKD可能会进展为终末期肾功能衰竭，导致不良预后[1]。目前，临床治疗DN主要包括生活方式干预，如运动、减肥、低钠饮食，以及控制高血糖和高血压的药物干预。但部分药物存在不良反应，且并不能完全延缓向终末期肾病的进展[2]。近年来，中医药通过辨证论治，在降糖降压基础上协调使用中药复方，能够增加疗效，有效延缓DN的发展[3-4]。

丹蛭降糖胶囊是安徽省名中医方朝晖主任研发的临床验方，由太子参、菟丝子、泽泻、水蛭、生地黄、牡丹皮6味中药组成，具有养阴活血、化瘀通络之效，可缓解炎症，抗氧化应激，改善肾纤维化等[5]。为进一步研究丹蛭降糖胶囊治疗DN的作用机制，本文采用网络药理学与分子对接技术，从“药物-成分-作用靶点-疾病”复杂网状结构，分析关键作用靶点、分子生物学过程、信号通路等，为其临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 丹蛭降糖胶囊活性成分筛选及对应靶点获取

检索TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[6]中太子参、牡丹皮、菟丝子、泽泻的化学成分，保留分子量180～500、脂水分配系数（AlogP）＜5、氢键供体数（Hlon）＜5、氢键受体数（Hacc）＜10、口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18的成分及对应靶点[7]。由于TCMSP未收录水蛭和生地黄，故检索其相关文献进行补充[8-11]。对于TCMSP中无靶点的成分，在BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中以“Pvalue＜0.05”且“Score cutoff≥39”为标准预测其有效靶点[12]。对于不满足要求但相关药理活性强，且OB值及DL值符合要求的成分也纳入其中。利用UniProt数据库（http://www.uniprot.org/），限定状态为通过试验验证（Swiss-prot），物种为“Homo Sapiens”，检索得到靶点对应的基因名，对所有基因去重，得到丹蛭降糖胶囊活性成分的作用靶点。

1.2 糖尿病肾病相关靶点筛选与获取

以“Diabetic kidney disease”和“Diabetic nephropathy”为关键词，检索OMIM数据库（http://www.mim.org）[13]、GeneCards数据库（http://www.genecards.org）[14]、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）[15]中DN相关靶点，其中GeneCards数据库以Score值≥中位数为靶点筛选标准。将结果合并去重后，获得DN靶点。

1.3 丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病交集靶点获取

利用Venny2.1.0在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）得到丹蛭降糖胶囊活性成分靶点和DN靶点的交集靶点。采用Cytoscape3.9.1软件构建丹蛭降糖胶囊“活性成分-交集靶点”网络，采用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，筛选介数中心性较大的活性成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及核心靶点筛选

将交集靶点导入STRING数据库（http://string-db.org）[16]，设置物种为“Homo Sapiens”，选择minimum required交互得分：high confidence（0.700），隐藏孤立节点，得到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。将数据导入Cytoscape3.9.1构建丹蛭降糖胶囊治疗DN的PPI网络，运用CytoHubba插件，以介数中心性、紧密中心性、度中心性排名前10位的节点为核心靶点。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

将交集靶点导入Metascape数据库（http://www.metascape.org）[17]，选择物种为“Homo Sapiens”，自定义分析默认P＜0.01，分别进行GO功能和KEGG通路富集分析，其中GO功能包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3个部分，选取各部分P值排序前10位的条目和KEGG前20位的通路进行可视化展示。

1.6 分子对接验证

在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）导出核心成分的3D结构，利用PyMOL软件转化为PDB格式，再从RCSB PDB数据库（http://www.rcsb.org）中获得核心靶点的蛋白晶体结构，利用PyMOL软件去水、清除原配体并保存为PDB格式，运用AutoDockTools软件对核心成分进行调整电荷、选择扭转键等处理，对核心靶点采用加氢等处理，最终以PDBQT格式导入AutoDock Vina[18]中进行分子对接，获取丹蛭降糖胶囊核心成分治疗DN的证据支持。

2 结果

2.1 丹蛭降糖胶囊活性成分与对应靶点

检索TCMSP和相关文献后，得到太子参活性成分3个、牡丹皮6个、菟丝子7个、泽泻5个、水蛭4个、生地黄7个，共有活性成分4个，去除无靶点的5个成分，最终得到丹蛭降糖胶囊组方药物26个活性成分，见表1。共获得活性成分靶点267个。

2.2 糖尿病肾病相关靶点筛选结果

检索TTD、OMIM、GeneCards数据库，共得到DN相关靶点17 134个，对GeneCards数据库靶点进行4次中位数筛选，合并靶点后得到853个DN相关靶点。

2.3 丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病的作用靶点

将活性成分靶点与DN相关靶点导入Venny2.1.0在线平台，得到109个交集靶点。因水蛭成分栀子苷和生地黄成分对应的靶点与疾病靶点无交集，故最终保留24个活性成分。利用Cytoscape3.9.1软件构建丹蛭降糖胶囊“活性成分-交集靶点”网络，见图1。该网络共有138个节点和291条边。通过CytoNCA插件筛选介数中心性排名前5位的活性成分为核心成分，分别为quercetin（槲皮素）、ursolic acid（熊果酸）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、isorhamnetin（异鼠李素），见表2。

表2 丹蛭降糖胶囊治疗DN核心成分

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与核心靶点

采用Cytoscape3.9.1构建丹蛭降糖胶囊治疗DN的PPI网络，网络包含109个节点，884条边，平均每个靶点与16个靶点有相互作用，表明靶点之间存在密切联系，见图2。利用CytoHubba插件，以介数中心性、紧密中心性、度中心性筛选核心靶点，得到丹蛭降糖胶囊治疗DN的核心靶点8个，见表3。

2.5 GO功能与KEGG信号通路富集分析

采用Metascape数据库对109个交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，得到461个GO条目，其中BP条目262个，多富集在对无机物质的反应、细胞迁移的正调节、对激素的反应等；CC条目85个，主要为膜筏、囊泡腔、转录调控复合物等方面；MF条目114个，主要为信号受体激活剂活性、转录因子结合、磷酸酶结合等。P值排序前10位的条目见图3。

图3 丹蛭降糖胶囊治疗DN靶点GO功能富集分析图

KEGG通路富集分析得到169条信号通路，主要涉及癌症信号通路（Pathways in cancer）、脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、胰岛素抵抗（insulin resistance）等。前20位通路见图4。

图4 丹蛭降糖胶囊治疗DN靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.6 分子对接结果

将5个核心成分与8个核心靶点进行分子对接，结果显示，木犀草素、山柰酚、槲皮素等成分与核心靶点STAT3、EGFR、AKT1、VEGFA、TP53、JUN、IL6的结合能均小于-5.0 kcal/mol，表明两者结合活性较优[19]，见图5。对EGFR与木犀草素、熊果酸分子对接进行可视化，见图6。木犀草素与EGFR氨基酸残基MET793、GLN791、SER720形成氢键相互作用，与VAL726、LEU718、ALA743、MET790形成疏水相互作用；熊果酸与EGFR氨基酸残基ASP837、PRO877形成氢键相互作用，维持与EGFR稳定构象。

图5 丹蛭降糖胶囊治疗DN核心成分与核心靶点分子对接结合能值热图

图6 EGFR与木犀草素、熊果酸分子对接示意图

3 讨论

丹蛭降糖胶囊中太子参甘温以补脾肺之气、止汗生津；生地黄滋肝肾之阴，填骨髓，逐血痹；菟丝子补肾阳益精气；牡丹皮、水蛭活血散瘀通络；泽泻化脂降浊。全方攻补兼施，共奏养阴活血、益气生津、化瘀通络之效。研究表明，丹蛭降糖胶囊可改善早期DN微炎症状态，降低尿白蛋白排泄率，有效改善DN患者临床症状[20]。

本研究根据介数中心性值筛选的前5位核心成分中，除熊果酸，其余均属于黄酮类化合物，具有减少炎症因子生成、抗氧化、促进细胞增殖等生理活性。研究表明，槲皮素可减轻体内氧化应激反应，干预转化生长因子-β1和Smad7通路，保护肾功能[21]。此外，槲皮素还可恢复线粒体自噬，从而延缓大鼠肾小管上皮细胞衰老和抑制肾间质纤维化[22]。炎症反应和氧化应激被认为是DN的主要病理生理机制。木犀草素可抑制炎症因子释放，如白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α，还可抑制活性氧产生[23]。山柰酚可通过增强胰高血糖素样肽-1和胰岛素释放，延缓肾纤维化[24]。异鼠李素可增加肾组织中的自噬体，抑制自噬基因miRNA调控，改善肾功能[25]。熊果酸属五环三萜类化合物，具有抗炎抗氧化等作用，可通过Toll样受体4介导的炎症途径，缓解炎症并抑制糖尿病诱发的肾病[26]。

PPI网络显示，丹蛭降糖胶囊可通过多靶点发挥治疗DN作用，其中有8个核心靶点与其他靶点联系最为密切。STAT3是一类携带SH2结构域的转录因子，可介导细胞对IL等其他炎症因子的反应。研究表明，肾小球内皮细胞（GECs）中的STAT3可被炎症介质激活，从而促进炎症因子释放，损害GECs功能，促进DN发展[27]。炎症是DN的主要致病机制。TNF是一种促炎症介质，可与TNFR1受体结合，激活MAPK3信号通路，介导细胞凋亡并调节DN的炎症发展[28]。IL-6是一种炎症细胞因子，可诱使系膜细胞增殖、纤连蛋白表达增加和肾小球内皮细胞通透性改变[29]。AKT1与系膜基质增殖、基底膜增厚、足细胞损伤和肾小管上皮细胞转化密切相关[30]，槲皮素可能通过影响AKT1抑制足细胞增殖，从而延缓DN进展[31]。TP53是一种细胞周期阻滞的调节因子，MicroRNA-770-5p通过TP53调节的细胞凋亡抑制剂调节足细胞凋亡，从而参与DN发展[32]。EGFR是ErbB家族的受体酪氨酸激酶，被激活后会诱导氧化应激和内质网应激反应，可引起肾脏肥大和纤维化[33]。JUN可通过促进与肾纤维化有关基因表达，加快肾纤维化[34]。DN属于糖尿病的微血管病变，VEGFA可诱导内皮细胞增殖和迁移，影响肾脏病理血管的生成[35]。以上研究结果显示，丹蛭降糖胶囊活性成分可能通过调控这些重要靶点，对DN的发展进程产生一定的影响。

GO功能富集结果显示，丹蛭降糖胶囊在酶结合、细胞外基质、细胞凋亡和增殖及迁移调控等方面有特异作用，表明丹蛭降糖胶囊可通过不同的生物学过程发挥其不同的分子作用治疗DN。KEGG通路富集分析显示，晚期糖基化终末产物（AGEs）能产生持续的氧化应激反应，导致相应的血管组织受损。其与AGEs受体（RAGE）结合并激活AGE-RAGE通路，AGE-RAGE通路在糖尿病介导的血管钙化中起重要作用，全身抑制RAGE对降低糖尿病并发症的影响有可能成为今后的研究方向[36]。胰岛素抵抗可影响多个器官和胰岛素调节途径。在胰岛素抵抗状态下，AMPK下调导致正常生理调节机制发生紊乱，信号通路相关蛋白调控发生改变，促使IL-6、IL-1、TNF-α等多种炎症因子释放，损伤肾脏，破坏肾功能[37]。松弛素是一种肽类激素，已成为一种速效且安全的抗纤维化药物。有实验表明，松弛素可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制上皮-间充质转化，保护肾小管上皮细胞功能，从而缓解肾纤维化的过程[38]。

丹蛭降糖胶囊能够调控以TNF、STAT3、VGEFA、IL6等关键靶基因为中心的分子网络，调节AGE-RAGE信号通路、胰岛素、松弛素信号通路等降低肾脏氧化应激反应、抑制肾脏纤维化。这与现有研究[39]相吻合，在一定程度上验证了预测结果的可靠性。虽然丹蛭降糖胶囊为临床常用药物，但对于其相关的药理机制研究相对较少，因此今后仍需更加全面深入的临床研究以验证其作用机制。