蒙药肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的作用机制研究*

贾 鑫,刘红爱,王玥璇,李斌鑫,朱小玲,董 玉

(1.内蒙古医科大学附属医院药学部,呼和浩特 010059;2.内蒙古自治区蒙药药效物质与质量控制工程技术研究中心,呼和浩特 010110;3.内蒙古医科大学药学院,呼和浩特 010110;4.内蒙古自治区国际蒙医医院药学部,呼和浩特 010065)

缺血性心脏病(IHD)是指由于长期心肌缺血导致心肌局部或弥漫性纤维化,继而引起心脏功能受损,该病为内蒙古地区常见多发病,近年来其发病率持续上升且危害较大[1]。蒙医学认为IHD 属蒙医“心赫依病”范畴,蒙医认为心脏为脏腑之首,是全身气血运行的通道和枢纽,赫依功能变化、气血运行受阻等是心赫依病发病的主要原因,蒙医治疗心赫依病独具特色且疗效显著。

肉豆蔻五味蒙语名为“匝迪-5”,是蒙医临床治疗心赫依病的经典方剂,该方源于《蒙医药方汇编》,现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准(蒙药分册)》[2]。该方由肉豆蔻(50 g)、木香(40 g)、土木香(40 g)、广枣(25 g)、荜茇(5 g)组成,以味辛,性温,效腻、重,镇心赫依之良药肉豆蔻为主,配以广枣增强心功能,土木香平气血不和、止痛,木香行气止痛、调节脾胃,荜茇平喘,故对心悸,气喘,心刺痛,心赫依病等效果显著。课题组前期研究结果显示:肉豆蔻五味对大鼠心肌缺血具有较好的保护作用[3]。

研究表明,肉豆蔻挥发油可促进缺血再灌注损伤心肌的恢复,对心脏具有较好的保护作用[4];木香内酯、萜类成分具有解痉镇痛、保护心血管的作用[5];土木香三萜、黄酮类成分对心肌梗死具有一定的治疗效果[6];广枣是蒙医治疗心血管疾病的常用药,其发挥治疗作用的主要化学成分为黄酮类[7]。荜茇生物碱和酰胺类化学成分对冠心病、心绞痛有一定的治疗作用[8]。课题组前期对肉豆蔻五味的化学成分进行了系统的提取、分离及鉴定[9],但对其治疗IHD 的药效成分及作用机制尚不明确。本研究通过网络药理学方法筛选药效成分、关键靶点及通路,从多方面进行了肉豆蔻五味有效成分与生物靶点的交互分析,系统、全面地研究肉豆蔻五味治疗IHD 的作用机制,并为肉豆蔻五味治疗IHD 的药效物质基础研究提供新的思路和方法。

1 方法

1.1 肉豆蔻五味化学成分搜集及其靶点筛选、IHD靶点筛选

通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以“肉豆蔻”“木香”“土木香”“广枣”“荜茇”五味药材为关键词进行搜索和收集,获取肉豆蔻五味的化学成分。

在生物学中,生物利用度(OB)是一项关键的药动学参数,描述的是口服药物被人体吸收以及进入血液循环的速率和数量;类药性(DL)是对药物设计的一项定性描述,它用于评估化学成分的潜在“药物化”程度;通常OB值越高,则表明药物活性分子的类药性(DL)越好。通过TCMSP平台,筛选五味药材中OB≥30%且DL≥0.18的化学成分,同时结合课题组前期研究成果,确定肉豆蔻五味的活性成分。

蒙药活性成分发挥治疗作用是通过与特定的生物分子靶点相结合从而发挥调节其生物活性或转录水平的作用。通过系统生物学的方法在PubChem Compound(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中检索活性成分的SMILE 结构,并在Swiss Target Prediction数据库检索其作用靶点,最终建立蒙药肉豆蔻五味活性化合物靶点数据库。IHD 靶点筛选:在TTD 数据库(https://db.idrblab.org/ttd/)、Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET 数据库(http://www.disgenet.org/web/DisGe NET/menu/home)中输入关键词Ischemic Heart Disease(IHD),搜索已报道的与IHD 相关的靶点基因,去除重复项,与肉豆蔻五味活性成分靶点进行匹配,搜集肉豆蔻五味活性成分治疗IHD 的潜在作用靶点。

1.2 肉豆蔻五味活性成分-IHD潜在靶点网络构建

运用Cytoscape 3.6.1软件构建肉豆蔻五味活性成分-IHD 疾病靶点交互网络图,并使用其Network analysis插件进行网络特征分析。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

在STRING 数据库中,录入“1.1”项下活性成分与疾病共同靶点,设置蛋白种类“Homo sapiens”及最低相互作用阈值为0.4,获取蛋白质之间的交流信息后在Cytoscape软件中构建肉豆蔻五味活性物质关键靶点PPI网络,并对其进行拓扑分析。

1.4 生物过程与通路分析

通过DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov/),将所得到的潜在靶点输入数据库,进行基因本体(GO)分类富集分析和KEGG 通路分析。最后,将分析得到的靶点通路与肉豆蔻五味活性成分对应,构建活性成分-靶点-通路网络。

1.5 肉豆蔻五味活性成分-IHD靶点分子对接

选择得分前五的化学成分作为肉豆蔻五味的主要活性成分,并通过Chem Draw 制图保存为cdx文件,将这些活性成分放入Chem 3D 中,以便其转化为三维格式。使用Chem 3D 的MM2力场对所有微小分子进行能级调整,在调整结束后以pdb格式进行保存。从蛋白质晶体结构数据库(http://www.pdb.org)获取成分-靶点-疾病网络中度值前五的目标蛋白数据,并使用Autodock(ADT)4.2软件计算药物分子结合该蛋白的可能形态,通过电脑自动评分的方式,选出能量最低的构象作为配体和受体的理想形态,同时采用Discovery Studio(DS)软件进行可视化的展示。

2 结果

2.1 化学成分-靶点网络节点图的构建

运用TCMSP平台筛选的过程中,识别出28个具有活性的化合物(OB≥30%和DL≥0.18)。前期试验数据显示,方剂中木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯、土木香内酯、二氢土木香内酯和珊塔玛内酯的含量较高[10-12],且具有明显的药效,然而由于其OB和DL 数值低于筛选准则,未被系统接收。本次研究中,将这6种成分纳入活性化合物的考察范围(见表1)。

表1 肉豆蔻五味潜在有效成分基本信息Table 1 Basic information of potential effective ingredients of Nutmeg-5

2.2 作用靶点预测及活性成分-作用靶点网络构建

从Swiss Target Prediction数据库中获取了肉豆蔻五味的化学成分靶点,然后去重、筛选、整合,发现有34种活性成分,与其相关的靶点有807个。进一步通过TTD、Drugbank、DisGeNET 数据库查询和汇总,发现有476个靶点与IHD 有关联。最终筛选出104种活性成分-疾病靶点。

借助Cytoscape软件构建了活性成分-IHD 作用目标网络(图1),可知肉豆蔻五味中的活性成分-IHD的作用目标网络包含138个节点和265条边。图1显示多个活性成分能对多个靶点产生作用,同时,每个靶点与多个活性成分相关联,说明肉豆蔻五味发挥药效在于其多成分、多靶点共同作用下的结果。

2.3 蛋白-蛋白互作用网络构建与分析

PPI网络分析(图2)中共有37个节点,167条边,其中节点表示蛋白,边表示蛋白之间的关联程度,度值越大、节点越大,在整个网络中的作用越大。利用Cytoscape软件运算每个节点的拓扑性质,并对治疗IHD 的肉豆蔻五味关键功效目标进行筛选。在蛋白质互作用网络中挑选出度值超过平均度值的主要节点,并按顺序将关键功效目标输入到DisGe NET 数据库以获取靶点相应的类型。

图2 PPI网络分析图Fig.2 Protein-protein interaction network analysis diagram

2.4 基因功能与通路分析

利用DAVID 数据库对PPI网络筛选出的活性成分相关的靶标开展GO 和KEGG 分析,设立P＜0.05为阈值,并将P值从小到大排列,选取排名前10的生物过程(共筛选出9个)和途径,采用Graph Pad Prism 8.0作图。GO 富集分析主要涵盖以下几个方面:生物过程(Biological process,BP)、分子功能(Molecular function,MF)及细胞组分(Cellular component,CC)。

BP富集分析的结果表明,肉豆蔻五味活性成分治疗IHD 主要与诸多生物流程相关(图3)。例如,提升蛋白磷酸化的正向调控,促进血管再生以及血管再生的正向调控,以脂多糖为引导的信号通路,提高胞质钙离子浓度的正向调控,以及正向调节一氧化氮生物合成过程。经过CC富集分析的研究,发现肉豆蔻的五种活性成分主要是通过与膜蛋白(Plasma membrane)、膜陷阱(Caveola)、细胞器膜(Organelle membrane)、细胞外空间(Extracellular space)、膜筏(Membrane raft)等作用治疗IHD。根据MF研究,肉豆蔻五味生物活性成分在IHD 治疗上的主要作用包括:结合血红素(Heme binding)、与酶结合(Enzyme binding)、与胰岛素受体底物结合(Insulin receptor substrate binding)、与转录因子结合(Transcription factor binding)以及与同一蛋白质结合(Identical protein binding)。

图3 肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis for Nutmeg-5 ingredients in treatment of IHD

KEGG 通路分析结果见图4,关键通路包括:肿瘤坏死因子通路(11个关键靶点)、肿瘤蛋白多糖(13个关键靶点)、癌症通路(15个关键靶点)、血管内皮生长因子信号通路(8个关键靶点)、低氧诱导因子1信号通路(9个关键靶点)。阐明肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的主要活性成分影响的关键作用位置分布在各类代谢途径中,其治疗缺血性心脏病的机制可能是多成分多靶点协同发挥作用。

图4 肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的KEGG 通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis for Nutmeg-5 ingredients in treatment of IHD

2.5 肉豆蔻五味治疗IHD活性成分-靶点-信号通路网络模型

将选出的肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的关键靶点、活性成分和信号通路汇入Cytoscape 3.7.2软件中,基于此构建成分-靶点-信号通路网络模型。该模型图由78个节点和243条边形成,图中节点的大小表示其在缺血性心脏病治疗中的影响力度,节点越大作用越大,见图5。

图5 肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病活性成分-靶点-信号通路网络Fig.5 Active component-target-pathway network of Nutmeg-5

经过分析,推测磷脂酰肌醇-4,5二磷酸肌醇-3激酶(PIK3CA)、非受体酪氨酸激酶2(JAK2)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、血管内皮生长因子受体(KDR)、PIK3CB、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)是网络图中的核心节点,很可能是肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的主要靶点。每一个活性成分可能影响多个靶点和通路,每个靶点也可能涉及多个活性成分和通路,同时,不同的路径可能因共享靶点而相互关联,结果表明各通路可能通过协同作用发挥疗效。

2.6 肉豆蔻五味活性成分-IHD靶点分子对接分析

当配体和受体结合的自由能降低时,结合更加牢固,因此可能产生相互作用的概率愈发提高。由图5看出,肉豆蔻五味中木香烃内酯(MX-3)、去氢木香内酯(MX-4)、异土木香内酯(TMX-1)、土木香内酯(TMX-2)、二氢土木香内酯(TMX-3)5个活性成分与通路及靶点关联度较高,所以确定这5个成分为肉豆蔻五味治疗IHD 的主要活性成分。在成分-靶点-疾病网络中,5个度值最高的目标蛋白质是PTGS2(PDBID:3TZI)、PIK3CA(PDBID:4A55)、JAK2(PDBID:6E2Q)、MAPK14(PDBID:7BQD)和KDR(PDBID:2P2I)。将5种活性成分和这5个靶点分别进行对接,对接的具体结果见表2。筛选出的5个活性成分与5个关键靶点对接时的结合自由能均为负值,说明结合能量低,成分与靶点容易结合,故两者易产生关联;如果结合自由能为正值或数值越大则结合能量高,成分与靶点不容易结合,二者也就不会产生关联。因此,肉豆蔻五味中此5种活性成分可通过不同的代谢通路作用于多个靶点上,发挥治疗IHD 的作用。

表2 蒙药肉豆蔻五味主要活性成分与关键靶点蛋白分子对接自由能Table 2 Docking conformations of the main bioactive chemical constituents in Nutmeg-5 and target protein

3 讨论

肉豆蔻五味为蒙医临床治疗心赫依病的常用方剂,但实际应用中仍存在药效物质不清晰、功能主治不明确的现象。“心赫依”疾病在蒙医临床上包括了心悸、心神恍惚、头晕眼花、神经过度疲惫、失眠和体力疲惫等多种病症,其涵盖的范围广泛且并不明确。本研究以蒙医临床治疗心肌缺血常使用的方剂肉豆蔻五味作为研究对象,在早期研究的基础上,运用网络药理学的方法从蒙药配方整体角度收集和筛选与药物化学成分相互作用的生物靶标,以及与疾病相关的关键靶点,从而构建了“药物-疾病-靶点-通路”的网络药理学研究模型。研究结果系统地展现了肉豆蔻五味活性成分、关键靶点、通路与IHD 之间的相互对应关系,通过分析疾病、化学成分、靶点、通路之间的关联性可探索肉豆蔻五味相关信号通路及其作用机制。

经过网络分析,筛选到的活性成分可能会影响与缺血性心脏病相关的主要靶点,推断这些元素可能是治疗缺血性心脏病的关键,这些活性成分将为后期药效作用的验证提供必要的物质支持。筛选到的靶点包括PIK3CA 和PIK3CB,这是磷脂酰肌醇3激酶(PI3Ks)的催化产物,其通过磷酸化过程可以触发一系列的细胞内信号传递[13]。研究报告指出,Nedd4L 可以增加PIK3CA 的泛素化并推动其蛋白质降解,以此通过抑制PI3K/Akt通道的信号传输来发挥对心肌肥厚的治疗作用[14]。PTGS2可以将花生四烯酸转化为前列腺素H2,这对动脉硬化、血栓、血管重塑、高血压等疾病有重要影响[15]。MAPK14在炎症、肿瘤、缺血/再灌注伤害、心肌重组等领域也起到关键作用[16]。Khan等人的研究显示再灌注心肌会上调丝氨酸-苏氨酸激酶,下调p38MAPK 活性[17]。因此,MAPK 在缺血性心脏病和体外循环心肌保护方面具有重要的临床意义。通过PLCG1的激活,产生了二酰基甘油和肌醇1,4,5-三磷酸这两种细胞信号分子,并对NOS2和NOS3进行调节,使得内皮细胞产生信号分子一氧化氮(NO)。一氧化氮(NO)作为主要的活性成分,具有介导心肌、血管平滑肌、血管内皮细胞等的程序性死亡的功能,从而在缺血性心脏病中起了核心驱动的作用[18-19]。此外,这些靶点与众多IHD 调控通路和多个活性成分相关联,进一步推断这些靶点与IHD 有关系,为将来在细胞和分子层面上验证药物效果提供了基础。

利用网络药理学方法,研究明确了蒙药肉豆蔻五味中的34个活性成分和35个重要靶点通过TNF等多条通路对治疗缺血性心脏病发挥作用。揭示了多靶点有可能同时与多条调控路径和多种活性成分关联,筛选到的活性成分可能同时作用于多个靶点,并且在关键调控通路中存在多个与IHD 关联的靶点。此研究充分展示了蒙药的多成分、多靶点、多通路同步发挥治疗作用的优点,为深入研究肉豆蔻五味治疗缺血性心脏病的药效物质基础及作用机制研究提供了重要的参考和依据。