载维生素C橄榄油微乳体系的构建及抗氧化能力研究

郭静，蒋建国，程爱民，张占军

扬州市职业大学生物与化工工程学院，扬州市农产品智能测控与清洁生产工程技术研究中心（扬州 225009）

橄榄油作为地中海饮食中脂肪的主要来源，其中丰富的脂肪酸（如油酸、亚油酸、亚麻酸等）及微量伴随物（如角鲨烯、生育酚和多酚类物质等）使其在预防心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化等方面有着独特的营养与保健功效[1-2]。然而，脂肪酸易发生自氧化及光氧化，这导致橄榄油在储存过程中容易产生不良风味，营养价值受损[3]。有研究表明，维生素C（vitamin C，VC）对乳液体系中的油脂具有抗氧化作用[4]，并且与其他抗氧化剂复配能够表现出较好的协同抗氧化作用[5-6]。维生素C又称抗坏血酸，是一种水溶性维生素，主要由一个五元内酯环及其侧链构成[7]。VC能够有效清除体内活性氧[8-9]，在食品、生物医药等领域被广泛用作稳定剂和抗氧化剂[10-11]。然而，VC对环境极为敏感，极易发生氧化降解[7,9]，这导致其在相关领域中的应用受到限制。

微乳液具有外观透明、热力学稳定、可自发形成等特点[12]，在药物、活性物传递等领域有着广阔的应用前景。课题组前期以生物相容性较高的大豆卵磷脂和非离子表面活性剂司盘80复配作为表面活性剂，制备以橄榄油为油相的食品级微乳体系[13]。试验从体系应用角度出发，制备可负载VC的橄榄油微乳液，充分发挥反相微乳体系对VC的包埋作用。同时，将橄榄油与天然抗氧化剂VC相结合，利用VC的抗氧化特性，提高体系的抗氧化性能和橄榄油的稳定性。试验旨在对体系的相行为、结构及抗氧化性能进行分析，为VC等水溶性活性物的包埋及在食用油体系中的应用提供理论依据和数据参考，对于新型乳液制品的开发具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆卵磷脂（纯度＞90%，上海Aladin生化科技股份有限公司）；2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS，纯度≥98%，Sigma-Aldrich有限公司）；溴化钾、氯化钾、L-抗坏血酸（VC）、无水乙醇、过硫酸钾（K2S2O8）：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；司盘80（Span80）、橄榄油：均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司；水为去离子水。

1.2 仪器与设备

Vortex-Genie2涡漩混合仪（美国Scientific Industries公司）；DDS-11A数显电导率仪（上海雷磁新泾仪器有限公司）；UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司）；DK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；Barnstead Lab Tower EDI 15超纯水仪（美国Thermo Scientific公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 拟三元相图的绘制

将大豆卵磷脂、Span80和无水乙醇按照质量比3︰1︰2在具塞管中混合均匀，作为表面活性剂相。将表面活性剂相与油相（橄榄油）按照质量比分别为1︰9，2︰8，3︰7，4︰6，5︰5，6︰4，7︰3，8︰2，9︰1和10︰0进行混合，制得表面活性剂/油混合物体系。在25±0.1 ℃水浴条件下，向混合物体系中逐滴加入水相溶液（纯水或VC水溶液），当体系刚好由澄清、透明转变至浑浊时，以该临界点作为体系的相转变点，并记录所加水相的质量。计算体系中水相所占质量百分比，以确定相转变点在拟三元相图中的位置。

1.3.2 空白及载VC橄榄油微乳体系的制备

以橄榄油为油相，大豆卵磷脂、Span80及无水乙醇按质量比3︰1︰2混合作为表面活性剂相，将表面活性剂相与油相按照固定质量比9︰1进行混合，加入纯水或VC水溶液，制备空白及载VC橄榄油微乳体系。

1.3.3 电导率的测定

以不同浓度VC水溶液（0，0.001，0.010，0.050和0.500 mol/L）为水相，在25±0.1 ℃、表面活性剂相与橄榄油质量比9︰1条件下，制备不同水相含量的大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄榄油/VC/水微乳液。采用电导率仪，以0.01 mol/L氯化钾溶液进行校准，在25±0.1 ℃下测定体系的电导率，并绘制不同VC浓度时电导率与水相含量的关系图。

1.3.4 傅里叶变换红外光谱分析

分别以纯水及0.5和1.0 mol/L的VC水溶液作为水相，固定表面活性剂相与橄榄油质量比9︰1，制备空白及载VC微乳液（Φ=15%）。采用溴化钾压片法，对VC固体、微乳液样品等进行红外光谱分析，扫描波数范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.3.5 抗氧化能力分析

采用ABTS法测定样品的自由基清除能力，即抗氧化能力。参照文献[14-15]方法，并稍作改进：配制含7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8的水溶液，并将其避光冷藏至少12 h，以使两者充分反应生成ABTS+·自由基。将ABTS+·自由基溶液以无水乙醇稀释至吸光度为0.70±0.01（754 nm）。

以浓度0，0.001和0.010 mol/L的VC水溶液为水相，制备水相含量分别为0，3%，9%和15%的大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄榄油/VC/水微乳体系，并采用无水乙醇将体系分别稀释10倍（V/V）。以蒸馏水为溶剂，将水相（0.001 mol/L VC/H2O溶液）稀释至与微乳液中水相含量（3%，9%和15%）相当，使水溶液中VC浓度分别为3×10-5，9×10-5和1.5×10-4mol/L。在10 mL试管中依次加入100 μL样品溶液、2 mL稀释后的ABTS+·自由基溶液，振荡使其混合均匀，并于室温避光静置20 min，测定其在波长754 nm处的吸光度。每组试验重复测定3次以上，按照式（1）计算样品对ABTS+·自由基的清除率。

式中：A1和A2为样品溶液和空白溶液分别与ABTS+·自由基溶液反应后所测得的吸光度。

1.4 数据统计

采用AutoCAD 2007软件绘制拟三元相图，并对相图中微乳单相区的面积进行计算（以单相区面积占相图总面积的百分比表示）[13]。采用Origin 8.5软件对试验数据进行处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 水相中VC浓度对微乳体系相行为的影响

图1为以不同浓度VC水溶液为水相时，大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄榄油/VC/水的拟三元体系相图（25℃）。随着水相中VC浓度的增加（依次为0，0.001，0.010，0.100和0.500 mol/L），体系微乳有效区域面积未发生明显变化（微乳单相区面积依次为15.6%，14.8%，15.1%，15.2%和15.3%）。VC分子由于C-2、C-3位羟基pKa值差异[16]（分别为11.4和4.2）的影响，在水溶液中表现为一种有机弱酸。水相溶液中VC浓度的增加，对体系界面膜的曲率和弹性影响较小，导致对微乳体系相行为影响不大。彭春玉等[17]在研究反相微乳液的导电性能时也发现，随着水相中氢离子浓度的增加，离子型反相微乳体系（CTAB/正己醇/正己烷/水）相当稳定，且溶水量并未减少。

图1 橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水拟三元体系相图（阴影部分为微乳液单相区）

由图1可见：在以不同浓度VC水溶液作为水相情况下，当表面活性剂相（大豆卵磷脂/Span80/无水乙醇质量比3︰1︰2）与油相（橄榄油）质量比9︰1时，体系表面活性剂含量相对较高，对水相的增溶量均达到最高。因此，选择最长稀释线，即固定表面活性剂相与油相质量比为9︰1，将两相混合后加入VC水溶液进行水相稀释，制备载VC橄榄油微乳液，并在此基础上，对体系结构等进行后续表征。

2.2 水相中VC浓度对体系电导率的影响

电导率的测定是区分微乳液结构类型的经典方法[18-19]。分别以不同浓度VC水溶液（0，0.001，0.010，0.050和0.500 mol/L）为水相，制备橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水体系，考察体系电导率（σ）随水相含量（Φ）的变化情况，结果如图2所示。随着水相含量的增加，体系电导率总体呈先上升后下降的趋势，Φ为0时，表面活性剂、助表面活性剂形成反相胶束，由于反相胶束中离子对极性较小[17]及表面活性剂中杂质的影响，体系电导率值较低。Φ超过4%时，体系电导率急剧上升，体系出现电导渗滤现象[20]。这主要是由于加入水相溶液后，液滴肿胀且相互之间碰撞的几率增加，液滴融合并形成导电通道[17,20]，因此，体系电导率迅速增加。此时，体系为W/O型结构。Φ达到18%时，体系电导率随水相含量的增加上升缓慢，并逐渐趋于最大（Φ=20%）。此时，导电通道进一步扩大、连接，形成网络结构[21-22]，体系由W/O型转变为双连续型结构。然而，进一步增加水相含量，体系开始出现浑浊，电导率下降。由于微乳体系中水增溶量超过临界值，表面活性剂界面膜被破坏，油、水分层，阻碍水相液滴间的相互作用及电荷传递[23]，因此，电导率下降。

图2 橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水体系电导率随水相含量（Φ）的变化

由图2可见：水相中VC浓度增加至0.5 mol/L时，体系电导率值整体偏低，但水相含量低于20%时，体系依旧能保持澄清、透明，表明其稳定性未受影响。VC为具有环状结构的多羟基化合物，增加水相中VC的浓度会使过量的VC分子游离于油水界面膜上，且分子间通过氢键形成聚集体，影响离子的穿透[17]，体系因而出现电导率相对偏低的现象。

2.3 橄榄油微乳体系红外光谱分析

将表面活性剂相（大豆卵磷脂/Span80/乙醇质量比3︰1︰2）与橄榄油按质量比9︰1进行混合，制备表面活性剂/油混合物体系（Concentrate）。分别以纯水及较高浓度VC水溶液（0.5和1.0 mol/L）为水相，制备空白及载VC的W/O型微乳液（Φ=15%）。对Concentrate及各微乳液进行红外光谱分析，以考察VC加入对体系结构的影响，结果如图3所示。对比图3（A和B）可以看出，VC经微乳体系包裹后，即使不断增加水相中VC浓度，VC自身特征峰（C＝C伸缩振动[24-25]为1 672 cm-1；参与氢键的内酯C＝O伸缩振动[24,26]为1 755 cm-1；样品中因含有水分而引起的O—H伸缩振动[24]为3 528，3 411，3 316和3 217 cm-1）均消失。另外，与空白微乳液相比，载VC微乳液在红外光谱的峰形和数量上未发生明显变化，且未出现新的特征峰。由此证明，VC被包裹于反相微乳液的亲水内核中。

图3 VC固体（A）、Concentrate体系（大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄榄油）及橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水微乳体系（B）红外光谱图

由图3（B）可见：Concentrate体系在3 258 cm-1附近出现宽而钝的羟基缔合峰[25,27]，这主要是由于（助）表面活性剂分子（Span80、大豆卵磷脂、乙醇）间通过氢键发生缔合。在Concentrate体系中加入水相溶液后，无论以纯水还是以不同浓度VC水溶液（0.5和1.0 mol/L）为水相，体系在3 258 cm-1处的吸收峰均向高波数方向移动。这主要是由于体系中加入水相溶液（Φ=15%），形成W/O型微乳液，水分子被束缚于胶核内部，导致出现峰形尖锐的游离羟基峰[25,28]。另外，随着水相中VC浓度的增加，水相中VC分子之间、VC与水分子之间及VC与表面活性剂亲水头基之间通过氢键逐渐形成链状缔合体，链端羟基中O—H键强度变弱[27]，导致O—H伸缩振动峰逐渐向低波数方向移动（3 639，3 634和3 630 cm-1），由此也反映VC分子被包裹于橄榄油微乳液的水相内核中。

2.4 橄榄油微乳体系抗氧化性能分析

以0，0.001和0.010 mol/L VC水溶液为水相，测定不同水相含量（Φ=0，3%，9%和15%）时，橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水体系对ABTS+·自由基的清除率，结果如图4和图5所示。由图4可见，Concentrate体系（大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄榄油）具有一定的自由基清除能力，这主要是由于橄榄油中含有的多酚、生育酚等物质及表面活性剂卵磷脂均具有一定抗氧化性[29-30]。另外，纯VC水溶液对自由基清除率与其中VC浓度明显呈正相关。

图4 Concentrate体系（大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄榄油）及不同浓度VC纯水溶液（3×10-5，9×10-5和1.5×10-4 mol/L）对ABTS+·自由基的清除率

图5 橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水微乳体系对ABTS+·自由基的清除率随水相含量（Φ）的变化

由图5可以看出，以纯水为水相时，随着水相含量的增加，空白微乳液（橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/H2O）对ABTS+·自由基清除率逐渐下降，这主要是由于随着水相含量的增加，空白微乳体系中大豆卵磷脂、橄榄油的含量相对减少，导致体系对自由基的清除能力逐渐下降。水相溶液中加入极少量VC（0.001 mol/L）时，随着微乳液中水相含量的增加，体系对ABTS+·自由基的清除率仍明显下降。但水相含量较高（Φ=9%和15%）时，载VC反相微乳体系的抗氧化能力则稍有提高。这表明水相溶液中加入少量VC（0.001 mol/L），能够在一定程度上发挥VC的抗氧化作用，提高微乳体系的抗氧化能力。但在该条件下，微乳体系的抗氧化能力仍主要受体系中大豆卵磷脂、橄榄油含量的影响。水相中VC浓度增加至0.01 mol/L时，各水相含量下微乳体系对自由基的清除率均明显增加，且自由基清除率与水相含量之间明显呈正相关。由此可见，水相中VC浓度达到0.01 mol/L时，水相含量的高低对反相微乳液体系的抗氧化能力具有显著的影响，此时，组分VC在体系中的含量成为影响微乳体系抗氧化能力的关键因素。

3 结论

以橄榄油为油相、VC水溶液为水相，制备载VC橄榄油微乳体系。采用拟三元相图法考察VC的加入对橄榄油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/水微乳体系相行为的影响。结果表明，水相中VC浓度的改变对微乳有效区域面积无明显影响。通过电导率、傅里叶红外光谱的测定对体系结构进行研究，结果发现，水相含量低于18%时，体系为W/O型微乳液，VC分子被包裹于W/O型微乳液的水相内核中。增加水相中VC浓度，微乳体系稳定性未受影响，但VC浓度较高（0.5 mol/L）时，大量VC分子游离于表面活性剂界面膜，导致体系电导率整体下降。以ABTS+·自由基清除率为指标，对体系的抗氧化能力进行分析。结果表明，橄榄油微乳体系水相中加入较低浓度VC（0.001 mol/L）时，体系抗氧化能力主要受体系中大豆卵磷脂、橄榄油含量的影响。水相溶液中VC浓度增加至0.01 mol/L时，组分VC在体系中含量的高低成为影响体系抗氧化能力的关键因素。试验将VC与橄榄油微乳体系相结合，通过对VC的包裹，提高体系的抗氧化能力，为进一步研究抗氧化剂VC对微乳体系中橄榄油的稳定作用机制等提供依据，并为研发新型乳液制品提供理论指导。