超声辅助浸提烤肉蘸料中多元素检测前处理方法

杜华楠，佘铁军，杨英娇，王姣，范雯谡，张蕾

齐齐哈尔市疾病预防控制中心（齐齐哈尔 161000）

烤肉是齐齐哈尔地区特色美食，随着烤肉文化的影响和商业化推广，烤肉的受众群体越来越多，作为烤肉“伴侣”的烤肉蘸料越来越值得重视。烤肉蘸料是结合区域特色食品而生的一种复合调味料，其主料为花生、大豆、芝麻等，其余辅料，不同厂商配比各不相同，烤肉中污染物的限量要求遵循GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》，而GB 31644—2018《食品安全国家标准 复合调味料》中大部分限量要求，特别是元素部分则引用GB 2762—2017，但复合调味品为混合物，很多限值及检测方法由于其类别归属不明确而无法确定，所以针对烤肉蘸料中多元素检测特点，建立一套实用性强、效率高、稳定性好、针对性强的烤肉蘸料中多元素检测方法是有必要的。

针对烤肉蘸料等复合调味品的研究主要集中在有机领域对风味物质的检测和对违规食品添加剂的检测，对需要精确定量的元素检测研究较少[1-3]，因重金属代谢周期长，易沉积在体内，所以对烤肉蘸料中元素的质控更应做到未雨绸缪[4-6]。如：Korkmaz等[7]针对土耳其常见的15种香料中微量元素和镉含量进行研究；范文秀等[8]通过微波消解法-等离子体发射光谱法对王守义麻辣鲜、炖鸡肉香料等10种天然复合调味品中7种金属元素进行检测，研究优化消化程序，并对检测数据进行统计分析。

复合调味料元素检测前处理方法、检测方法以及其之间的组合较多，多参照食品中元素检测的方法，如微波消解、干法消解、火焰原子吸收、石墨炉法等[8-9]，但是烤肉蘸料的特点是原料中主要成分油脂含量较大，对消解条件要求较为苛刻，需要高温度且长时间消解，如微波消解温度达200 ℃以上，易造成挥发性元素的损失[10-11]，降低温度缩短时间会造成消解不完全影响检测[12]。试验研究乙醚超声萃取-微波消解法，通过乙醚超声浸提处理，去除样品中大量油脂[13]，对微波消解进行“减负”，最大程度减少挥发性元素损失，保证检测方法的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烤肉蘸料（齐齐哈尔市售）；金属多元素混合标准品（美国安捷伦公司）；68%硝酸（优级纯，美国Merck牌）；双氧水（优级纯，沪试牌）；无水乙醚（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯水（实验室纯水机自制）；高纯氩气、高纯氦气（齐齐哈尔市售）。

1.2 仪器与设备

安捷伦7900型电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS，美国安捷伦公司）；Mars6型微博消解仪（美国CEM公司）；微型破碎机（德国IKA公司）；BP211D型分析天平（德国赛多利斯公司）；超声波发生仪；Milli-Q型去离子水发生器（美国Millipore公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理方法

称取0.5 g市售烤肉蘸料，如样品粉碎粒度不够细则需重新粉碎，以免影响消解效果，样品称量后编号，待处理。

1.3.2 乙醚超声浸提方法单因素试验

以无水乙醚为溶剂，在超声辅助下对样品中的油脂进行浸提[14]。

超声浸提工艺参数的确定[15]：分别对烤肉蘸料中的常量元素Fe、微量元素Pb、易挥发元素Hg这3种元素进行检测，为增强对比效果，Fe、Pb元素直接检测，Hg元素含量少易挥发损失进行加标后检测；分别对超声浸提的功率、温度、时间3个主要参数进行单因素试验，超声功率单因素区间25～65 W，超声温度单因素区间20～60 ℃，超声时间单因素区间10～50 min，单因素试验指标设为Q，按式（1）计算。

式中：C0为应用超声浸提辅助前处理方法检出元素含量，mg/kg；C1为常规前处理检出元素含量，mg/kg。

1.3.3 响应面试验设计

各元素在消解过程中挥发损失的程度不同，应以易损失元素确定消化条件。与其他元素相比，Hg元素更易损失，以Hg元素检出值为响应值设计中心组合（Box-Behnken）试验，自变量因素为超声功率、超声温度、超声时间，Q（Hg）为响应值，自变量水平编码见表1。

表1 因素水平编码表

1.3.4 微波消解方法[16-17]

将经过乙醚超声浸提后的样品进行除溶剂处理，放入消解罐中，加入8 mL消解液[硝酸与双氧水（HNO3与H2O2）体积比6︰2]，冷消化1 h，设定2套微波消解程序。第1套微波消解程序为普通方法参数，第2套微波消解程序为配合超声浸提的微波消解程序。详见表2。

表2 微波消解条件

1.3.5 金属元素检测方法

检测方法采用ICP-MS法，该方法与传统的原子荧光、原子吸收检测法相比，可多元素进行同时检测，具检测效率高、灵敏度高、检出限低等优势。其中：K、Ca、Na、Mg、Fe等常量元素检测标准序列范围为0～10 000 ng/mL；B、Al、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo，Cd、Sn、Sb、Ba、Pb、Li等微量元素检测标准序列范围为0～500 ng/mL；Hg元素因其含量低、易残留等原因需要单独测定，标准序列范围为0～3.0 ng/mL；超出曲线部分可进行稀释后检测，具体检测条件见表3。

表3 ICP-MS检测条件[18-19]

1.3.6 超声乙醚浸提对微波消解条件的影响[14]

以Hg元素回收率为指标对空白组样品进行不同浓度梯度的加标回收试验，详见表4。

表4 加标回收试验条件表

1.3.7 确定方法检出限、定量限[20]

根据单因素试验及响应面优化法确定试验参数，对烤肉蘸料中常见的26种元素检测方法的检出限、定量限进行计算，按式（2）和（3）计算。

式中：SMDL为检出限；SLOQ为定量限；σ为空白样品或被测物定量限界附近的样品测定值的标准偏差；Sslope为检出限/定量限附近标准曲线的斜率。

2 结果与分析

2.1 超声浸提单因素试验

2.1.1 超声浸提功率单因素试验

按照1.3.2的试验设计进行，超声功率作为单因素变量，分别选取25，35，45，55和65 W，另外2个定量分别设置为超声时间30 min、超声温度40 ℃，超声浸提处理后对样品进行脱溶剂处理待测，计算Q值。由图1可以看出，3种元素的Q值变化趋势一致，在25～45 ℃区间呈正比关系，在45～55 ℃区间3种元素Q值略有小幅波动，总体呈平稳趋势，超过55 W后3种元素Q值均有略微下降趋势。形成该趋势主要原因为浸提实质是传质过程，超声功率加大，超声空化作用加强，浸提体系内局部形成的液体喷流动能加大对细胞壁等组织机构冲击力加大，提高细胞结构通透性，提高传质效率[15]，另外加大超声功率可加速体系内质点运动作用，同时提高超声功率可迅速排除物料中气体加快溶质进入[21]，但也不可使用过大功率，因为空化作用与超声频率密切相关，在超声振幅一定时超声功率增大超声频率增加，会引起整个体系空化阈值增加，空化作用难以继续增强甚至会有减弱趋势[22]，选择适当功率的低频率的超声条件，更有利于超声浸提。

图1 超声功率对Q值的影响

2.1.2 超声浸提温度单因素试验

按照1.3.2的试验设计进行，超声温度作为单因素变量，分别选取20，30，40，50和60 ℃，另外2个定量分别设置为超声时间30 min、超声功率45 W，超声浸提处理后对样品进行脱溶剂处理待测，计算Q值。由图2可以看出，3种元素的Q值变化趋势一致，在20～40 ℃区间呈显著上升趋势，在40～50 ℃区间Pb元素Q值呈平稳趋势，Hg和Fe元素Q值略有增加，超过50 ℃后3种元素Q值均区域平稳，不再继续增大，甚至略有下降。形成该趋势主要原因是温度升高对超声热效应有辅助作用，提高体系内质点运动的速度，加之超声空化作用会产生具有高强动能的冲击波来改变植物细胞组织的通透性，从而达到提高浸提效率的作用[22]，并且一般常规体系的液体扩散系数与温度也呈现正相关关系，因为温度升高，液体体系黏度降低有利于提取[23]，但也不可一味提高温度，因为超声声能最后大部分转化为热能[24]，如局部温度过高会导致易挥发元素损失，而且温度过高会加快大分子降解，还会发生热裂解反应产生自由基[25]，而这2种因素都会影响浸提效率和效果。

图2 超声温度对Q值的影响

2.1.3 超声浸提时间单因素试验

按照1.3.2的试验设计进行，超声时间作为单因素变量，分别选取10，20，30，40和50 min，另外2个定量分别设置为超声温度40 ℃、超声功率45 W，超声浸提处理后对样品进行脱溶剂处理待测，计算Q值。由图3可以看出，在0～20 min内3种元素Q值均随着超声时间的增加而增加，20～30 min内3种元素Q值略有增加，与前20 min内趋势相比增加速度明显减慢，30 min后曲线趋势趋于平稳或略有下降趋势。形成该趋势主要原因是超声介入通过空化作用产生的冲击力，改变细胞组织的通透性，通过微波热作用和直流作用加速质点运动，溶剂迅速进入物料细胞组织，并且将物料缝隙中的气体迅速排除，传质阻力降低[26]，浸提效率大幅提高，随着超声浸提时间的延长，整个体系达到一个平衡状态，此时继续延长超声浸提时间，数据趋势没有明显变化。

图3 超声时间对Q值的影响

2.2 超声解吸条件响应面优化试验

响应面优化试验设计按照1.3.3中表1的试验设计方案进行，三水平三因素试验设计方案及检测结果见表5。应用Design Expert 8.5.0对数据进行分析和处理，得到的试验结果回归拟合模型为R1=2.79+0.50A+0.29B+0.27C+0.25AB-0.18AC-0.047BC-0.84A2-0.50B2-0.28C2。Q（Hg）的响应面回归模型方差分析结果见表6。

表5 响应面设计方案及试验结果

表6 Q(Hg)的响应面回归模型方差分析

表7 响应面寻优结果

由表6得出，在响应面模型二次项中，A、B、C、AB、A2、B2、C2的P值均小于0.01，极显著，交互影响评定，AB、AC交互作用显著，其中AB交互极显著，BC交互作用不显著。回归模型P＜0.000 1，模型极显著，失拟项P＞0.05，不显著，模型响应值Q（Hg）的二次多项回归方程决定系数R2=0.987 6、调整系数Radj2=0.971 7，说明模型模拟的精密度、回归效果及拟合度良好，可信度高，模型可真实反映各因素与响应值之间的联系。根据回归模型，做出关于3个超声浸提因素与响应值的响应面分析图，结果如图4所示。

图4 Q(Hg)响应面图

按照所得整理值对回归模型进行验证性试验，试验结果Q（Hg）为2.99 mg/kg，结果证明响应面优化所得预测值与试验值之间的拟合性良好，模型所得参数切实可行真实有效。

2.3 超声浸提处理对微波消解条件的影响

按照1.3.5的试验设计方案进行试验，其中超声浸提参数采用2.2中优化出的参数，分别对3种浓度梯度的加标样品进行检测。由结果可知，第1组、第2组加标回收率相近，第3组最低，第4组结果最高。由于第1和第2组应用的微波消解温度较高，所以会造成Hg元素的损失，而且损失量大体相近。第3组没有应用超声浸提除去油脂，直接应用低温消解的方式，造成消化不彻底，影响检测准确性，特别是在0.05 mg/kg这个浓度加标回收率已经＜60%。第4组为试验重点研究的方法，加标回收率为4组试验中最高，对易挥发性元素检测准确性较高，加标回收率达到测组分含量1～100 mg/kg、回收率范围90%～110%，测组分含量0.1～1 mg/kg、回收率范围80%～110%，测组分含量＜0.1 mg/kg、回收率范围60%～120%的标准。结果详见表8。

表8 加标回收试验结果

2.4 多元素检出限定量限的确定

按照1.3.6的试验设计，采用2.2中优化出的超声解吸参数进行试验，结果各元素检出限（SMDL）定量限（SLOQ）均低于GB 5009.268—2016中的要求，详见表9。

表9 方法检出限、定量限

3 结论

通过超声辅助浸提法与低温微波消解法相结合，去除样品中大量油脂，解决烤肉蘸料多元素检测过程中，样品油脂含量过大导致消化不完全及消化温度高部分元素损失的问题。通过Box-Behnken试验对方法参数进行优化，得到最优超声浸提工艺参数：超声浸提功率50 W、超声浸提温度43.6 ℃、超声浸提时间36 min。应用响应面模型所得参数进行试验，测得Q（Hg）为2.99 mg/kg。通过4组试验对不同浓度梯度的Hg进行加标回收试验，超声辅助浸提低温微波消解法加标回收率最高，表明烤肉蘸料等高油脂含量样品中多元素检测，可通过乙醚超声浸提除油处理，降低微波消解温度梯度，减少易挥发元素的损失。应用试验方法对26种元素进行检出限、定量限检测和计算，结果均符合国标要求。试验对烤肉蘸料等高含油量的样品中金属离子检测领域的发展具有一定意义。