Supervillin isoform 4(SV4)通过增强Aurora A活性调控细胞有丝分裂

毕文旭, 张思钰, 李抒洋, 王 薇, 陈学冉, 方志友*

(1)中国科学院合肥物质科学研究院健康与医学技术研究所, 合肥 230031;2)中国科学技术大学研究生院科学岛分院健康与医学技术研究所基础医学中心, 合肥 230026)

有丝分裂是真核细胞平等分离其已经复制的染色体到2个子细胞中的过程。在细胞有丝分裂过程中,染色质浓缩包装形成形态与数量一定的染色体,同时,γ-微管蛋白环复合物和其他微管调节因子被募集到中心体使其激活和成熟,微管成核并与复制的染色体相互作用形成其分离所需的双极纺锤体,染色体向相反的两极分离[1-2]。作为细胞中主要的微管组织中心,中心体的正确激活和成熟对于协调有丝分裂期间双极纺锤体的形成及染色体的准确分离至关重要[3-4]。Aurora A是细胞在有丝分裂期间中心体成熟和纺锤体组装的重要调控蛋白质[5-7]。Aurora A的活化受到共作用因子TPX2(TPX2 microtubule nucleation factor)的影响,Aurora A与TPX2结合后,Aurora A的构象发生改变,激酶活性增强[8-9]。

Supervillin是绒毛蛋白/凝溶胶蛋白超家族中最大的亚家族,可与F-肌动蛋白、肌球蛋白II等多种细胞骨架蛋白质结合[10-11],调节细胞的黏附、极化、扩散、运动和迁移[12-13]。目前,已经鉴定出supervillin蛋白的5种剪切异构体,它们都是由SVIL基因转录而来。其中,supervillin剪接异构体4(supervillin isoform 4 ,SV4)是在增殖细胞中supervillin家族内最大的剪接异构体,与supervillin异构体1(SV1)相比,包含额外的编码外显子3、4 和5 (exon 3-4-5)。

前期研究文献表明,supervillin参与肿瘤的发生发展过程。在肝癌中,supervillin促进内皮依赖性血管的发展并诱导血管生成拟态的形成[14]。在缺氧微环境中,supervillin还可以通过上皮-间质转换促进肿瘤细胞的侵袭和转移,进而促进肝癌的恶性进展,是肝癌患者的独立预后指标[15]。同时,supervillin可以通过降低肿瘤抑制蛋白质 p53 和下游靶基因的水平来增加细胞存活[16]。Supervillin还参与巨噬细胞运动的调节以及LPS诱导的 IL-6、IL-1β和 TNF-α上调的炎症反应[17],可以和KIR2DL1(killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 1)受体结合,阻断NK细胞的细胞毒性[18]。Supervillin的几种亚型在肿瘤发展的过程中发挥着重要作用,包括细胞存活,迁移和转移[19-20]。

Supervillin家族蛋白质在调节细胞分裂过程中也发挥着重要作用。例如,在细胞胞质分裂过程中,supervillin可以与KIF14(kinesin family member 14)、EPLIN(epithelial protein lost in neoplasm)等蛋白质相互作用,协调肌动蛋白和微管的运动功能[21]。Supervillin作为细胞外信号调节激酶3 (extracellular regulated protein kinase 3,ERK3) 的底物调节分裂细胞中的肌球蛋白 II 激活,促进胞质分裂[22]。有研究表明,敲低supervillin会导致细胞早期胞质分裂期间的分裂失败[21]。然而,早期研究并未对supervillin在有丝分裂期间的不同剪接异构体的功能进行区分研究。本文利用外显子Exon 3-4-5制备特异性抗体,对supervillin剪接异构体SV4进行研究,发现在细胞有丝分裂期间,SV4定位于中心体和细胞膜,其通过与TPX2-AurA复合物相互作用,进而调控Aurora A在中心体的募集和激活,帮助中心体的成熟和纺锤体的组装,从而保证有丝分裂中期微管正确组装与染色体正确分离。

1 材料与方法

1.1 仪器及图像处理

使用激光共聚焦扫描显微镜(EVOS M7000 3D;赛默飞世尔科技;美国)获得图像。使用Adobe Photoshop软件统一调整图像的对比度和亮度并进行合并。

1.2 抗体

文中描述的一抗包括supervillin抗体(HPA020138;sigma;美国)、β微管蛋白抗体(anti-β-tubulin )(#TA506805;Origene;中国)、anti-TPX2(#12245;Cell signaling technology;美国)、anti-Aurora A(#14475;Cell signaling technology;美国)、γ微管蛋白抗体(anti-γ-tubulin)(ab11317;abcam;美国)。

1.3 细胞培养和转染

本研究使用的所有细胞系都通过形态学观察定期验证,并测试无支原体污染。细胞被保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中,并添加10% 胎牛血清FBS(Gibco;美国)和1%青霉素/链霉素(Hyclone;美国)。培养箱在加湿的空气中,含5%的二氧化碳,温度为37 ℃。

靶向人类SV1/SV4 cDNA序列Stealth RNA (赛默飞世尔科技;美国) dsRNA转染细胞: siRNA#1∶5′-CCCCUGGAAGAUAUCGAAGCCAGAC-3′,siRNA#2∶5′-TATTAAGGTAGAAAGGTTGATTCGC-3。

1.4 质粒

EGFP标记的人SV1和SV4根据之前的报道制备[16,21]。利用PCR技术从SV1或SV4中扩增出SV1/4片段,亚克隆到pEGFP-C2 (Invitrogen)或p3xFlag-CMV(Sigma)中[16,23]。从人cDNA中PCR扩增人γ-微管蛋白,通过BglII/XbaI位点克隆到pEGFP-C1(Clontech)和p3xFlag-CMV(Sigma)。编码人Aurora A的质粒(#26293)购置于Addgene公司,通过消化生成Flag标记的Aurora A蛋白,通过BamHI位点连接到p3xFlag-CMV质粒。

甲亢是指血液循环中甲状腺激素过多，引起以神经、循环、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进，临床上以Grave’s甲亢多见，约占所有甲亢的80%～85%。Grave’s甲亢治疗主要有抗甲状腺药物治疗、131I治疗和手术治疗。131-I治疗Grave’s甲亢是核医学的传统优势项目之一，已有70余年历史，是目前成人Grave’s甲亢的首选治疗方法。本文旨在研究131I治疗Grave’s甲亢伴颈部血管杂音的剂量分析。

1.5 GST pull down分析

从pEGFP-SV4中利用PCR扩增人类SV4(外显子3-4-5,E3-4-5),并克隆到pGEX-6p-1(GE Healthcare)载体的EcoRI和SalI位点之间。转化至感受态细胞BL21中表达SV4-GST融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖珠(GE Healthcare)纯化。琼脂糖偶联的GST标记的SV4/E345(对照组为琼脂糖偶联的等量GST蛋白质)与U2OS全细胞裂解物在缓冲体系(25 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,150 mmol/L NaCl, 10%甘油和0.5% NP-40)4 ℃孵育3 h。离心清洗,加入1.2x SDS上样缓冲液(loading buffer),100 ℃水浴变性10 min,通过SDS-PAGE分离,Western 印迹进行分析。

1.6 免疫沉淀

HEK293细胞在含10%胎牛血清(Gibco)的完全培养基中培养。将编码Flag标签的γ-微管蛋白、Aurora A或SV1截断片段的质粒与GFP标记的SV1、SV4及其截断片段或γ-微管蛋白瞬间转染HEK293细胞。在裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L NaF,1 mmol/L NaVO4,0.5% NP-40和蛋白酶抑制剂混合物)中制备全细胞裂解物,并在4 ℃的条件下用抗Flag M2树脂(Sigma)免疫沉淀全细胞裂解物数小时。经裂解缓冲液洗涤后收集复合物,用抗Flag、GFP和相应的抗体进行免疫印迹实验,检测共沉淀蛋白质。

1.7 延时显微成像

将control siRNA和SV4 siRNA分别转染到HeLa细胞48 h,每3 min拍摄1次图像,在蔡司显微镜下对HeLa细胞进行活细胞的观察。在显微镜下,在含10%FBS的 OPTI-MEM培养基中孵育细胞,培养环境为37 ℃和5% CO2。

将control siRNA和SV4 siRNA转染到U2OS细胞后48 h开始,每3 min使用蔡司多通道系统拍摄1次图像,对U2OS细胞中的H2B-GFP进行观察。在显微镜下,在含10%FBS的 OPTI-MEM培养基中孵育细胞,培养环境为37 ℃和5% CO2。

1.8 免疫荧光显微镜

为了检测内源性SV4和γ-微管蛋白或β-微管蛋白的总量,细胞在含0.25% Triton X-100的PHEM (60 mmol/L Pipes,25 mmol/L Hepes,10 mmol/L EGTA和2 mmol/L MgCl2)中孵育2 min,然后4%的多聚甲醛中固定。对于其他抗体,细胞在TBS中洗涤2次,并在4%的多聚甲醛中固定。免疫染色时,在室温条件下加入封闭液(TBS,4%山羊血清,0.2% Triton X-100)1 h后加入适当的一抗,并在4 ℃的条件下孵育过夜。用特定的二抗在室温下孵育载玻片1 h后用TBS冲洗。细胞核用DAPI复染,经TBS清洗,防荧光淬灭剂封片。用徕卡直立显微镜或尼康共聚焦显微镜进行观察分析。

1.9 微管再生试验

用100 ng/mL诺可达唑孵育有丝分裂的细胞3 h,冰上孵育30 min,破坏微管。为了评估微管再生的能力,用预冷缓冲液洗涤有丝分裂细胞2次以去除诺可达唑,37 ℃ 孵育5 min。固定的细胞用抗γ-微管蛋白和β-微管蛋白抗体染色,分析成核能力和中心体大小。从有丝分裂细胞中获取图像,通过在中心体周围绘制感兴趣的区域,使用ImageJ软件获得中心体区域的量化,进而确定中心体的大小。使用ImageJ测量信号,通过平均像素强度在纺锤极分析有丝分裂细胞内源性Aurora A、pT288-Aurora A或γ-微管蛋白,并对细胞质背景进行校正。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析,所有数据均以至少3个独立实验的平均值±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验进行分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在细胞有丝分裂中SV4表达定位于中心体

为了探索SV4的作用,在SV4野生型MEF细胞中使用纯化制备的SV4抗体(Fig.1A),发现该细胞中存在全长的SV4及它的蛋白质切割片段,而敲除SV4的MEF细胞在这些相应的区域处条带颜色变浅甚至消失。野生型U2OS细胞中也存在全长的SV4及相应的蛋白质切割功能片段。结果显示:在细胞分裂间期中,SV4弥散分布于细胞质与细胞膜(Fig.1B),在中心粒上也有分布。然而,在细胞有丝分裂期间,SV4在中心体上的定位信号从前期开始显著增强,并在中期达到最高(Fig.1C)。在末期和细胞质分裂期间,中心体处的SV4信号逐渐降低,并保持在较低的表达水平。与此相一致的是,在细胞分裂中期,GFP/myc标记的外源性SV4也定位于中心体,且与γ-微管蛋白存在明显地共定位,基于GFP标记的SV4信号虽然能在中心体部位存在定位,但是信号并不强,而Myc标记的SV4在中心体处的定位信号很强,进一步说明了SV4在有丝分裂中的功能及定位可能更集中于coiled-coil domain区域(Fig.1D)。这些结果表明SV4可能在细胞有丝分裂中期发挥着作用。

Fig.1 SV4 localizes to the centrosome and mitotic spindle poles (A) WT MEF , KO MEF and U2OS cells were immunoblotted with anti-SV4, and anti-Actin antibodies. (B) U2OS cells were fixed with pre-cold methanol for 5 minutes at -20℃, and immunostained with anti-γ-tubulin (green) and anti-SV4 (red) in interphase. The scale bars represent 10μm (left). High magnification views on the right indicate centrosome structures. The scale bars represent 1μm (right). (C) SV4 was stained with an anti-SV4 antibody (green), β-tubulin was stained with an anti-β-tubulin antibody (red) and the nucleus was stained with DAPI in U2OS cells via an immunofluorescence assay. (D) U2OS cells with stably expressed GFP and Myc-tagged SV4 were stained with anti-GFP or Myc antibodies (green) and an anti-β-tubulin antibody (red) to indicate the mitotic spindle. The scale bars represent 10 μm

2.2 SV4的缺失导致有丝分裂中期的迟滞及多极纺锤体的形成增加

为了进一步探索SV4在细胞分裂中的作用,利用延时成像技术对转染SV4 siRNA的U2OS细胞进行了实时观察(Fig.2A)。结果显示:在对照细胞中,细胞分裂前期到后期的时间约为32 ± 2 min (n=38,Fig.2B,Supplementary Movie 1)。在SV4敲低细胞中,时间约为104 ± 10 min (n=55,Fig.2B,Supplementary Movie 2)。在SV1/4双敲低细胞中,时间约为69 ± 6 min (n=41,Fig.2B)。SV1/4双敲除时,有一部分细胞阻滞在G2/M期,无法进入有丝分裂期[17,21],而SV4定位于中心体(Fig.1C),在有丝分裂期有更强的功能,因此SV4单独敲除对有丝分裂的阻滞效果更好。同时,利用免疫荧光染色技术观察了有丝分裂被阻滞的U2OS细胞中纺锤体的改变。结果显示:与对照siRNA相比,SV4 siRNA处理过的细胞倾斜纺锤体和多极纺锤体(有2个以上纺锤杆的细胞)明显增多(Fig.2C,D和E)。同时,SV4 siRNA组中拥有2个以上γ-微管蛋白阳性的中心体细胞数量也明显增加(Fig.2C和2D)。因此,这些结果提示,SV4参与了有丝分裂中双极纺锤极完整性的维持。

Fig.2 SV4 regulates the mitotic spindle organization at mitosis (A) Selected frames from time-lapse imaging of U2OS cells stably expressing GFP-tagged H2B treated with the control or SV4 targeting stealth siRNA. Time-lapse imaging began from 48 hours post-transfection with the control and SV4 siRNA. Experiments were repeated 3 times. (B) Duration of mitosis of time-lapse imaging of cells treated with the control or SV4 siRNA.***P<0.001, n=100 cells. (C) γ-tubulin was stained with an anti-γ-tubulin antibody (green), β-tubulin was stained with an anti-β-tubulin antibody (red) and the nucleus was stained with DAPI (blue) in U2OS cells via an immunofluorescence assay. The scale bars represent 10 μm. (D) Metaphase U2OS cells treated with the control or SV4 targeting stealth siRNA were immunostained with anti-TPX2 (green), anti-β-tubulin antibodies (red) and DAPI (blue).The scale bars represent 10 μm. (E) Percentage of disrupted poles, tilt spindles, and multipolar spindles in cells treated with the control or SV4 siRNA . n=50 mitotic cells per experiment

2.3 SV4促进中心体上γ-微管蛋白的募集和微管的形成

为了确定supervillin结构域的功能活性,根据supervillin结构域特征分别构建了一系列突变体(Fig.3A)。免疫荧光结果显示,SV1/4(825～1 270)区域与γ-微管蛋白共定位于有丝分裂中心体(Fig.3B)。免疫共沉淀结果显示:Flag标记的γ-微管蛋白仅可以与GFP标记的包含825～1 270区域的SV1/4存在相互作用,而与其他SV片段无相互作用关系(Fig.3A和3C)。此外,Flag标记SV截断(675～1 270)也证实可以与GFP标记的γ-微管蛋白共沉淀(Fig.3D)。这些结果表明,SV1/4中825～1 270区域在中心体生物活性调控中可能发挥重要作用,可能是决定supervillin定位于中心体的关键结构域。

Fig.3 Interaction of SV1/4 with γ-tubulin is required for γ-tubulin recruitment and mitotic spindle organization (A) GFP-tagged SV1/4 full-length and truncation constructs used in this paper. (B) Metaphase U2OS cells expressing GFP-tagged supervillin truncations were immunostained with anti-GFP (green), anti- β -tubulin antibodies (red), and DAPI (blue) for DNA. The scale bars represent 10 μm. (C) Flag-tagged γ-tubulin was transiently co-expressed with GFP-tagged SV1FL, SV4FL or truncations in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitation were probed with antibodies against the indicated proteins. (D) Flag-tagged coiled-coil domain of supervillin was transiently co-expressed with GFP-tagged γ-tubulin in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitation were probed with antibodies against the indicated proteins. (E) Synchronized U2OS cells were transfected either with the control or SV4 siRNA and were arrested in mitosis and microtubules were allowed to regrow (time point 30 minutes) after ice treatment, and fixed and stained with antibodies against γ-tubulin (green), β-tubulin antibodies (red) and DAPI (blue). The scale bars represent 10 μm. (F) The intensities of γ-tubulin that had formed around centrosomes in mitotic cells after 30 seconds of regrowth were quantified, and mean values were plotted as percentages of intensities in control and SV4 depletion cells.***P<0.001, (n=20 poles, error bars: SEM)

敲低SV4后,中心体上的γ-微管蛋白信号强度比对照组中期细胞下降约50%(Fig.2C),提示SV4的缺失导致γ-微管蛋白未被适当地募集到中心体。因此,通过微管再生研究分别检测对照组和SV4 siRNA组有丝分裂细胞中的中心体微管成核情况。结果显示:与对照组细胞相比,SV4敲低细胞中γ-微管蛋白定位于中心体的信号明显减少(P<0.001),且信号均为短微管和弱γ-微管蛋白(Fig.3E和3F)。因此,在SV4敲低细胞中,γ-微管蛋白不能被适当地招募到中心体,导致中心体介导的微管成核能力减弱。

2.4 SV4特异性结构域E3-4-5与Aurora A相互作用并参与Aurora A在中心体的募集和激活

在细胞有丝分裂中,SV4与Aurora A在细胞中存在明显的共定位(Fig.4A)。同时,利用U2OS细胞裂解液分别孵育GST和GST/SV4-E345融合蛋白,进行GST pull down实验。并利用质谱鉴定结合蛋白质。结果显示:Aurora A、TPX2和SV4-E3-4-5存在同一复合物中,它们之间可能存在相互作用,且Aurora A信号比TPX2更强(Fig.4B)。进一步的免疫共沉淀结果表明:Aurora A仅与SV4相互作用,与SV1无相互作用关系(Fig.4C),且与其它SV4结构域相比,Aurora A仅与SV4(1～1 250)特异性相互作用,且其结合也将促进TPX2与Aurora A的相互作用的增强(Fig.4D)。

Fig.4 SV4 activates Aurora A at mitotic spindle poles through interacting with TPX2 (A) U2OS cells were immunostained by an anti-SV4 antibody (red), an anti-Aurora A antibody (green) and DAPI (blue) in metaphase. The scale bars represent 10 μm. (B) GST and SV4-specific domain fusion proteins could pull-down Aurora A and TPX2 from HeLa cell lysates. (C) Flag-tagged Aurora A was transiently co-expressed with GFP-tagged SV1FL, SV4FL in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitation were probed with antibodies against the indicated proteins. (D) Flag-tagged Aurora A was transiently co-expressed with GFP-tagged SV1/4 truncations in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitates were probed with antibodies against the indicated proteins. (E) U2OS cells were transfected either with the control or SV4 siRNA. Metaphase cells were stained with an anti-β-tubulin antibody (red), an anti-Aurora A antibody (green) and DAPI (blue).The scale bars represent 10 μm. (F) The intensities of Aurora A at spindle poles in the control siRNA or SV4 siRNA treated cells,** P<0.01 (20 poles). (G) RPE1 cells transfected with individual control, SV4 and SV1/4 siRNAs targeting different regions of supervillin isoforms were immunoblotted with anti-supervillin, anti-TPX2 (C-terminal), anti-pAurA-T288, anti-Aurora A and anti-actin antibodies. (H) The intensities of SV1/4, Aurora A, phospho-Aurora A T288, TPX2 in control, SV4 siRNA, SV1/4 siRNA#1, SV1/4 siRNA#2-treated cells. Relative levels of indicated proteins were quantified by ImageJ. (I) U2OS cells were transfected either with control or SV4 siRNA. Metaphase cells were fixed and stained with an anti-β-tubulin antibody (red), an anti-phospho-Aurora A-T288 antibody (green) and DAPI (blue). The scale bars represent 10 μm. The lower right corner is the image magnified five times where the arrow points. (J) The intensities of phospho-Aurora A T288 at spindle poles in control or SV4 siRNA treated cells,*** P<0.001 (20 poles)

为了进一步探究在有丝分裂过程中SV4对Aurora A蛋白的调控作用,通过免疫荧光染色分别检测了对照组和SV4 siRNA组中Aurora A及pT288-Aurora A(Aurora A活化形式)的分布情况。结果显示:Aurora A虽然均可以定位于对照组和SV4缺失组细胞的纺锤体中,但是SV4 siRNA组细胞的Aurora A的分布发生了改变(Fig.4E)。对照组细胞的Aurora A蛋白水平未受显著影响,但SV1/4的双敲除降低了Aurora A和pT288-Aurora A蛋白水平以及TPX2的切割(Fig.4G和4H)。相比于对照组细胞,SV4 siRNA组细胞中Aurora A在中期中心体的相对荧光下调约44%(Fig.4E和4F,P<0.01),pT288-Aurora A的相对荧光下调高达60%(Fig.4I和4J,P<0.001)。

因此,这些结果提示,SV4有可能通过与TPX2-AurA复合物结合,促进Aurora A的激活及其在细胞分裂中的生物学功能发挥。

3 讨论

细胞有丝分裂的顺利进行需要基于成熟的中心体形成纺锤体微管,为分裂细胞提供动力,使染色体准确分离,保证亲代和子代之间遗传性状的稳定性。在有丝分裂进入期间,中心粒周围物质(pericentriolesmaterial,PCM)和中心粒周蛋白在中心粒周围积累,PCM中的Aurora A激酶通过磷酸化并激活中心体成熟调控性蛋白质Polo样激酶1(polo like kinase 1,PLK1),促进其定位到中心体,PLK1可以促进PCM的扩增和中心体的成熟,并加速纺锤体微管的成核[24]。纺锤体微管在中心体成熟后动态聚合和解聚,以捕获姐妹染色单体并将染色体运输到纺锤体赤道完成细胞的分裂[25]。

Supervillin作为肌动蛋白和膜相关蛋白质,在细胞迁移、运动及胞质分裂等过程中发挥着重要作用。本研究发现,SV4在细胞分裂间期信号较弱,且呈弥散状分布,而在细胞分裂期间表达不断升高,在中期达到最高,提示了SV4在有丝分裂中期发挥作用的事实。研究结果显示,SV4在细胞分裂期间定位于中心体,SV4的缺失导致细胞内多级纺锤体的形成及有丝分裂进程被阻滞。在SV4敲低细胞中,中心体的微管成核能力减弱。因此,SV4通过促进微管的成核能力,调控中心体的成熟及纺锤体的组装,从而保证有丝分裂的顺利进行。

本研究结果显示,SV4不仅定位于中心体,还定位在细胞膜上。SV1/4(825～1 270)区域与γ-微管蛋白共定位于有丝分裂中心体,而其他SV片段与γ-微管蛋白无相互作用关系,表明SV1/4(825～1 270)区域负责中心体的定位,并通过调控中心体的生物活性影响细胞有丝分裂的进程,而SV4表达降低对γ-微管蛋白在中心体定位的影响机制可能与其在中心体的功能相关,前期论文中也发现,SV1/4(825～1 270)结构区域与一些中心粒相关蛋白质相互作用,例如ODF2(outer dense fiber of sperm tails 2)和RHAMM(receptor for hyaluronan-mediated motility)等[21]。而只有SV4(1～1 250)区域,即SV4的N-端结构域具有明显的细胞膜定位。因此,SV1/4(825～1 270)区域可以结合中心体,SV4的N-端结构域则负责与细胞膜上的F-肌动蛋白和肌球蛋白II结合,在胞质分裂过程中为细胞产生机械力,使其分裂为2个子细胞。此前文献报道,supervillin 中的2个区域影响细胞分裂,分别是结合纺锤体蛋白的残基 831～1 281,以及结合肌球蛋白 II 重链 (MHC) 和长形式的肌球蛋白轻链激酶的残基 1～170[17],与本文结果相符。同时,Aurora A仅与SV4相互作用,而与SV1无相互作用关系,表明SV4的特异性结构域,即包含额外的编码外显子3、4 和5 (Exon3-4-5)区域可以募集Aurora A蛋白,并与其相互作用,促进Aurora A蛋白在中心体处的定位与激活。

Aurora A蛋白在有丝分裂的G2期出现并定位于中心体,参与调节有丝分裂的多个过程,包括中心体复制、成熟和分离,双极纺锤体的组装、有丝分裂进入的触发、中期染色体的排列、胞质分裂/脱落以及返回G1期[26]。Aurora A作为细胞有丝分裂过程中的调节剂,有报道称,Aurora A的下调和上调均能导致胞质分裂缺陷。这表明Aurora- A对细胞质分裂的影响不仅在于其表达水平,还在于其激活和失活的时机。事实上,Aurora A的激活和定位受到严格的调控。Aurora A活性的时空分布至少部分是由Aurora A激活剂所控制。例如,TPX2激活Aurora A是双极纺锤体组装所必需的[27-28];而Ajuba(Ajuba LIM protein)激活Aurora A是有丝分裂进入的必要条件[29];通过非有丝分裂,发现Aurora A、TPX2和SV4-E3-4-5存在于同一复合物中,且Aurora A与SV4(1～1 270)的特异性结合促进了TPX2与Aurora A相互作用的增强。免疫荧光染色结果显示,敲低SV4,在中期细胞的中心途径HEF-1(human enhancer of filamentation 1)激活Aurora A对初级纤毛的分解是必需的[30]。本研究利用GST pull down技术,Aurora A及其pT288-Aurora A的定位信号均显著下调。提示SV4促进Aurora A在中心体的募集和激活,TPX2可能是SV4与Aurora A发生相互作用的桥梁。

Supervillin能通过与细胞膜和肌动蛋白细胞骨架紧密结合介导肌球蛋白II激活和肌动蛋白动力学[31]。SV4作为supervillin的一个剪接异构体,在G2晚期中心体信号增强,而Aurora A在G2/M期也被募集到中心体。目前尚不清楚SV4何时以及如何激活Aurora A。SV4本身可能不足以激活Aurora A。SV4可能起到支架的作用,将Aurora A和它的激活剂(例如TPX2)结合在一起。

综上所述,本文发现,SV4除了定位在细胞膜上,在有丝分裂中期还能定位在中心体上,SV4在中心体的定位影响γ-微管蛋白的分布与微管成核,SV4通过与Aurora A的直接相互作用,并促进TPX2/AurA复合物在中心体的定位和成熟以及纺锤体的组装,在有丝分裂过程中发挥着不可或缺的作用。这一发现,有助于进一步理清supervillin蛋白在细胞周期过程中的功能与调控的分子机制,及其对肿瘤细胞增殖的影响,特别是其剪切异构体中的不同结构特征可能是其发挥功能的重要因素。