金属组学在肝癌诊断及治疗中的应用

张艳丽 毕鹏伟 江鑫垚 王永安 蒋婷婷 王 欣* 李 超

(1.安徽医科大学 第二附属医院 肿瘤科,合肥 230601;2.安徽医科大学 基础医学院 化学教研室,合肥 230032;3.安徽医科大学 第二临床学院,合肥 230000;4.安徽医科大学 第一临床学院,合肥 230032)

作为新兴的研究领域,金属组学旨在系统地研究金属/类金属及其物种与生物体内基因、蛋白质、代谢物和其他生物分子之间的相互作用与功能关系。金属组学系统研究生物体内金属/类金属元素的含量、形态、分布、结构及功能等。生命体系中的金属组存在稳态平衡,而疾病的发生发展可能会打破这一平衡状态[1-2]。因此,金属组学有望实现对疾病的辅助诊断与治疗。例如Scassellati在研究神经发育障碍疾病(精神分裂症、注意力缺陷多动障碍、自闭症及癫痫)中发现血液中锌的含量与之密切相关,可能是潜在诊断生物标志物[3]。

肝癌是全球范围内最常见与致死率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。根据“Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries”预测全球肝癌新发病例约为90.5万且死亡病例约为83.0万,发病率居恶性肿瘤的第6位且死亡率居第3位[4]。我国肝癌的发病率与死亡率亦很高,例如2016年我国肝癌新确诊病例数约为39.0万且死亡病例约为30.2万[5]。原发性肝癌的病因与发病机制尚未完全明确,可能与以下因素有关:1)病毒性肝炎;2)黄曲霉素;3)肝硬化;4)饮用水污染;5)遗传因素;6)其他:亚硝胺类、偶氮芥类、有机氯农药、酒精等[6]。肝癌起病隐匿,缺乏典型的、特异性的临床症状,约80%肝癌患者在确诊时已处于中晚期,导致总生存率低,因此早期诊断与治疗肝癌是当前亟待解决的问题[7]。

肝癌现有的诊断方法包括影像学诊断(B超、CT、MRI及PET/CT)、血清学检查(AFP)与病理组织学检查,但上述诊断方法对早期诊断肝癌具有一定的局限性,例如:B超容易受到肝脏病变、胆囊、肠道及其他组织器官的影响,从而降低了诊断肝癌的准确率[8];肝癌的异质性导致CT和MRI可能产生漏诊[9];AFP是早期筛查肝癌的主要肿瘤标志物,但约40%的原发性肝癌患者的AFP位于正常水平[10];病理学检查是肝癌诊断的金标准,但部分患者不能耐受穿刺活检,且病理结果受到穿刺部位与诊断医生经验等的影响,可能会产生漏诊或误诊[11]。因此寻找新的肝癌诊断方法迫在眉睫。

肝癌的治疗方法有手术、放疗、介入与药物治疗等。手术是早期肝癌患者的主要治疗方式,药物治疗则为不适合局部治疗的中晚期肝癌患者的首选治疗方式,目前以铂类药物为主[12]。

本文主要系统总结近年来金属组学在肝癌诊断及治疗中的应用情况,为建立新的肝癌筛查方法和治疗手段提供有益借鉴。

1 金属组学常用的检测方法

金属组学常用的检测方法包括对其含量、形态、分布、结构等进行分析,目前在肝癌的研究中以金属元素含量的分析为最常见。常见的金属元素含量检测手段有原子吸收光谱(Atomic absorption spectroscopy,AAS)、电感耦合等离子体-质谱(Inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)、电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES)及X射线荧光光谱仪(X-ray fluorescence spectrometer,XRF)等。

AAS法是一种应用非常广泛的检测金属元素的分析方法,目前主要为石墨炉法与火焰原子吸收光谱法。石墨炉法的优点是所需样品量少、前处理方便且灵敏度高,缺点是准确性受石墨炉升温程序影响且比较复杂的样品分析时存在一定的背景干扰。火焰原子吸收光谱法的优点为操作简便、信号稳定、检测速度快等,缺点为灵敏度较低[13-14]。

ICP-MS法其工作原理是样品在ICP通道高温电离后进入质谱仪,利用元素之间的质荷比不同,用离子检测器检测,目前应用在很多领域如地质样品、生物样品、食品等。ICP-MS具有基体效应小、谱线简单、很低的检出限(ng/L)并能同时测定多种元素等特点[15-16]。

ICP-OES法是ICP与原子发射光谱相结合的分析技术。根据检测元素特征谱线对待测样品进行定性和定量分析,检出限为ng/g级,可测定大多数金属元素和少量非金属元素(如硅、磷、硫等)[17]。

XRF法的原理是利用初级X射线激发待测样品中的原子使之产生荧光,从而对样品进行定性(金属元素的类别)和定量(金属元素的含量)分析,是一种无损的快速分析方法,能够分析固体或粉状样品中多种元素[18]。

2 金属组学在肝癌诊断中的应用

微量元素与生理功能密切相关,它们在体内保持着动态平衡,缺乏或过量可使细胞发生突变,进而发生癌变。肝脏是微量元素吸收与储存代谢的场所,对微量元素的平衡起着重要的作用。金属组学可用于肝癌的辅助诊断及判断预后,目前常以血、头发和组织等为研究样本。

2.1 靶标金属组学

靶标金属组学通常用ICP-MS/MS、AAS及ICP-OES等对健康者与肝癌患者的样品进行定量分析,在测定前需对样品进行消化处理。

1)血样品(包括全血或血清)的研究。FU等[19]使用ICP-MS/MS准确测定了肝细胞癌(HCC)患者和健康者血清中的Mn、Fe、Ni、Cu、Zn和Se,发现HCC患者的Fe与Cu含量高于健康者而Zn与Se含量低于健康者,提示微量元素浓度的变化可能与HCC的风险有关。赵玉萍等[20]使用AAS检测了肝癌患者与健康者血浆中的五种金属元素(Ca、Mg、Cu、Fe、Zn),发现肝癌患者的Cu含量高于健康者而Ca、Mg、Fe、Zn含量低于健康者。高翠红等[21]使用AAS测定了肝癌和健康者全血中的Cu与Zn,发现Cu/Zn在肝癌诊断中价值最高,Cu有较高的诊断价值,Zn诊断价值较低。FANG等[22]使用ICP-MS测定了肝癌患者血清中Cu与Zn,发现较高的血清Cu与Cu/Zn提示预后差,与总生存密切相关。这种关联在慢性炎症患者和HBsAg阴性患者中最为突出,Zn水平与生存结果之间没有显著相关性。研究结果提示血清Cu/Zn可作为HCC进展和生存的预后指标。血样品的研究发现Cu/Zn和Cu具有较高的诊断价值。

2)头发样品相关的研究。我国乙型肝炎病毒感染率高,而乙型肝炎病毒随病情进展可引起的肝硬化及肝细胞癌。谢裕达[23]使用AAS测定了乙型肝炎、肝硬化、肝癌及健康者头发的Zn、Fe、Cu、Mn与Se,发现乙型肝炎、肝硬化、肝癌组的Zn、Mn和Se含量均显著低于正常对照组,Fe显著升高,肝癌组的Cu含量显著高于正常对照组。以上结果提示毛发中的微量元素的变化可能提示肝脏病变的进展,协助肝癌诊断。

3)组织样品相关的研究。刘志辉等[24]应用AAS测定血清和肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织样品中Zn、Cu、Mn和Se,发现原发性肝癌患者的血清Cu水平显著低于健康者,血清Zn、Mn与Se无显著差异,Zn、Cu、Mn与Se从癌组织、癌旁组织到正常肝组织依次升高。癌组织Cu含量与体重呈负相关,Mn、Se与年龄呈负相关。癌组织Zn含量与血清中的含量无相关性,Cu、Mn与Se在癌组织的含量与其血清中的含量呈正相关。蔡康荣等[25]应用ICP-OES测定了肝癌患者的癌组织、癌旁组织及正常组织中Se、Zn、Cu、Fe、Mg、Mn、Mo的含量,发现正常组织、癌旁组织、癌组织的Se、Zn、Mg、Mo含量与Se/Cu、Zn/Cu、Fe/Cu、Mg/Cu、Mo/Cu逐渐降低,但Cu、Mn的含量逐渐升高,Fe的含量与Mn/Cu无显著差异。

以上研究发现肝癌患者常伴有Cu和Cu/Zn升高,Se和Zn含量下降,提示肝癌发生、发展与微量元素含量的变化具有相关性,对研究肝癌病变过程和协助诊断具有重要意义。但靶标金属组学存在以下不足:样品处理过程烦琐、不同检测设备对样品结果的影响等。

2.2 非靶标金属组学

HE等[26]提出了非靶标金属组学方法,即无需转换XRF光谱为定量数据而直接比较XRF光谱以发现金属组学的差异。该方法样品处理过程简单,与机器学习相结合可以快速准确地区分癌症患者和健康对照者(图1)。

图1 非靶标金属组学流程图Figure 1 Non-targeted metallomics flow-process diagram.

3 金属组学在治疗中应用

金属组学除用于诊断,亦应用于研究金属药物治疗肝癌机制、研发新型金属药物及预测肝癌治疗效果中(图2)。

图2 金属组学在肝癌诊断及治疗中的应用Figure 2 Application of metallomics in diagnosis and treatment of liver cancer.

3.1 金属组学助力金属药物治疗肝癌机制研究

铂类是肝癌治疗中常用的药物,包括顺铂与奥沙利铂等。顺铂为第一代铂类抗癌药物,它通过与肿瘤细胞DNA链结合形成交叉连接从而抑制DNA与RNA的合成与细胞分裂。例如杜峰等[27]研究观察组(顺铂热化疗灌注联合TACE治疗)与对照组(TACE治疗)的疗效,发现观察组的肿瘤控制率、生存率均高于对照组,肿瘤复发率显著低于对照组,提示顺铂热化疗灌注联合TACE可有效控制肝癌,降低肝癌复发率并提高生存率。

奥沙利铂是第三代铂类抗癌药物,采用含奥沙利铂化疗方案治疗肝癌,可以提高治疗有效率,改善患者的生活质量。魏涛[28]研究观察组(常规化疗方案即亚叶酸钙与氟尿嘧啶加用奥沙利铂治疗)与对照组(常规化疗方案治疗),发现观察组的治疗总有效率、生活质量总改善率高于对照组,不良反应发生率低于对照组。

钒复合物是继铂类药物之后具有巨大开发潜力的金属药物。ESCALIANTE等[29]分别应用木葡聚糖与氧钒(XGC:VO)的复合物和天然XGC处理HepG2细胞,发现应用XGC:VO作用肝癌细胞72 h后细胞活力较天然XGC明显下降,证明XGC:VO能有效抑制肝癌细胞生长。

钌复合物毒性较小且副作用小。ALVES等[30]用钌复合物顺式-[Ru(1,10-菲咯啉)2(咪唑)2]2+(RuC)作用HepG2细胞,发现48 h后细胞活力降低63%,证明RuC能抑制肝癌细胞生长,是治疗肝癌的潜在新药物。

砷类药物如三氧化二砷(As2O3)治疗肝癌疗效显著,可延长患者生存周期,且不良反应少,安全性高。卞晓山等[31]研究观察组(As2O3经导管肝动脉化疗栓塞介入疗法)与对照组(常规肝动脉栓塞疗法)的疗效,结果显示研究组治疗后总有效率、1年生存率明显高于对照组,治疗后不良反应发生率明显低于对照组。应用As2O3经导管肝动脉化疗栓塞介入疗法效果显著,减轻单一经导管动脉栓塞化疗介入疗法对患者肝功能产生的损伤,从而减少不良反应的发生。

3.2 金属组学助力新型肝癌金属药物研发

微量元素不平衡状态可能是影响肝癌治疗效果的重要因素。翦耀文等[32]应用Meta分析法探讨肝癌患者血清微量元素水平。结果显示,肝癌患者血清Cu升高,血清Zn与Fe降低,说明肝癌患者微量元素水平处于不平衡状态。

Zn在各种锌酶中起着关键作用,而锌酶对维持肝功能至关重要。慢性肝炎、肝硬化或脂肪肝等慢性肝病(Chronic liver disease,CLD)患者的Zn浓度通常较低,随着肝纤维化的进展,Zn浓度会进一步降低。长期补Zn能改善肝功能并降低肝癌的发生风险。HOSUI等[33]选取267例CLDs患者的资料进行回顾性分析,分为补Zn组(196例,予ZnSO46个月)和对照组(71例),结果显示补Zn组3年事件(死亡、肝癌发展、肝衰竭出现)累积发生率显著低于对照组,补Zn组的肝癌发病率显著低于对照组。说明患者服用超过90 mg/d的Zn使其血清Zn浓度大于70 μg/dL时,能有效抑制肝癌发展。

Se在人体内含量极少却发挥着重要作用,具有提高机体免疫功能的作用。LIN等[34]采用荟萃分析与系统评价分析了50项研究,发现肝癌患者的Se水平显著低于健康志愿者。荟萃分析显示在安全剂量(<400 μg/d)内摄入Se是肝的保护因素,提示及早补充Se能够保护肝脏、预防肝癌,防止肝癌的发展及恶化。

Fe在机体内主要参与氧的运送和组织呼吸,以及维持正常造血功能等。肝脏是Fe储存的主要部位,也是Fe过多诱导损伤的主要靶器官。补充适量的Fe可以延缓肝癌的发展以及改善肝癌患者的营养状况和生活质量。RIZK等[35]选取401例肝硬化患者和181名肝癌合并肝硬化患者进行病例对照研究,结果显示,Fe的摄入量高于2.83 mg/d能够抑制肝硬化发展为肝细胞癌。

在药物治疗方面,金、银、铂、金属氧化物、钙与硒等纳米粒子已被用作药物递送系统中的治疗剂、载体或成像剂,如YANG 等[36]合成的纳米金颗粒能靶向肿瘤微环境,释放抗肿瘤药物,能提高肿瘤治疗效果。

3.3 金属组学助力肝癌治疗效果预测

肝癌患者体内存在着多种微量元素的异常变化,与肝癌的发生、发展、疗效及预后密切相关,检测肝癌患者治疗前后微量元素含量的变化对肝癌的治疗效果评价有一定的参考价值。于瑞珍等[37]应用AAS研究肝癌患者和健康者治疗前后血清中微量元素含量变化,结果显示治疗前肝癌患者血清Cu高于健康者,Zn、Fe、Se、Mn、Ni、Cd低于健康者;治疗后肝癌患者血清Cu降低,Zn、Fe、Se、Mn、Ni、Cd升高,但仍低于健康者。肝癌患者治疗后血清Zn回升,主要是病灶切除,症状好转,各种酶活性降低,Zn消耗减少所致;Fe回升与患者低铁性贫血症状改善,饮食增加,Fe消耗减少有关。

4 结论与展望

金属组学在肝癌的诊断及治疗中起着重要作用。随着技术的发展,新的金属组学诊断方法不断推陈出新,人工智能、大数据、机器学习与金属组学在肝癌早期诊断、分型、治疗及预后中的进一步应用将提升肝癌的早期诊断率及治疗效果,造福于患者。