碰撞/反应池电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定血液中16种元素

于宏洋 王 萌 汪 冰 王 娟 李孟楠 胡 克*

(1.北京莱伯泰科仪器股份有限公司,北京 101312;2.中国科学院高能物理研究所,北京 100049)

金属组学的研究对象是生命体系中所有的金属元素[1]。常用的血液中元素分析仪器分别是电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)[2]、电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)[3]、原子吸收光谱仪(AAS)[4]和原子荧光光谱仪(AFS)[5]等。其中,使用ICP-MS的分析技术目前应用最广泛,由于其具有灵敏度高、检出限低、动态线性范围宽、分析速度快、检测精度高等优点,同时又避免了光谱分析手段易受干扰的缺点。现阶段,ICP-MS的分析性能已经在食品[6]、环境[7]、刑侦[8]、地质[9]、医疗[10]、半导体[11]等领域得到充分验证。

测量血液中元素含量是评估人体健康状况的一个重要指标,很多元素参与人体多种生理机能和代谢[12]。本文测量血液中的16种元素(V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Se、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi)中,V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se是人体中的微量元素,剩余8种元素则属于有毒有害元素。

对血液样品进行前处理是ICP-MS分析微量元素的重要步骤之一。血液样品中存在大量的有机物和无机盐等干扰物质,这些干扰物质可能会影响到微量元素的分析结果[13]。因此,通常需要将血液样品进行消解[14-15]或稀释[16-17]等前处理步骤,以去除干扰物质,减少样品的复杂性,提高分析的准确性和精度。消解手段虽可去除有机物的干扰,但由于消解手段的不同,潜在问题有元素挥发损失、外源污染以及分次消解条件不同造成平行样品数量多等。稀释法一般采用硝酸溶液和曲拉通(Triton X-100)的混合溶液将样本血液稀释20～40倍后测试,虽容易产生较大的基体效应[18],但引入的试剂空白较少,简单易操作,仪器运行成本低,同时引入的基体效应可以通过优化仪器条件减少对检测结果的影响,故稀释法受到了更多医院与第三方检测机构的青睐[17]。

ICP-MS法在检测过程中受到样品引入方法以及机械结构的限制,离子化的样品会生成多原子离子,而一些多原子离子例如40Ar16O、40Ar40Ar等,由于会与诸如56Fe与80Se等被测核素有相近质核比,使质谱检测结果受到干扰,分析准确度受到很大影响[19]。碰撞反应池(Collision/Reaction Cell)技术是ICP-MS技术中的重要组成部分,单四极杆质谱中,从离子束路径来说,碰撞反应池的位置在四极杆之前,它通过引入反应气体和碰撞气体来控制和调节离子之间的相互作用,以减少或消除干扰效应,使ICP-MS法在分析样品时可以耐受更复杂干扰基质并且提高元素分析的灵敏度和准确性[20]。

首先通过分析16种元素ICP-MS法的灵敏度与检出限,以及对比氦气、氢气作为碰撞气时ICP-MS法消除干扰的能力,建立一种用于血液金属组学样本元素的快速定量测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器设备与试剂

LabMS 3000四极杆质谱仪(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)。质谱调谐液使用Be、Co、In、Ba、Ce、Pb、U元素的单标溶液(坛墨质检科技股份有限公司,下同)配制,使用2% HNO3稀释至1.0 μg/L。通入碰撞气后的仪器调谐与性能对比使用V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Se、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi共16种元素的单标溶液配制混合标准溶液,并以2% HNO3逐级稀释配制浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的标准曲线溶液。在线内标溶液使用Rh,以2% HNO3稀释至10.0 μg/L。全血检测使用上述16种元素的混合标准溶液,以含有0.1% HNO3与0.1% Triton X-100(Thermo Fisher Scientific)的稀释液逐级稀释配制浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L的标准曲线溶液。考虑到血液中Zn、Cu和Fe三种元素含量较高,对其额外配制1.0、10.0、100.0 mg/L的标准曲线溶液。全血样本取自CD-1实验小鼠(n=3,编号:Z143986、Z169538、Z750342,北京维通利华实验动物技术有限公司),用含有0.1% HNO3与0.1% Triton的稀释液稀释40倍。微量元素标准全血粉末(Seronorm,LOT:2011934),按照说明书溶解并用含有0.1% HNO3与0.1% Triton的稀释液稀释40倍。实验用水均为超纯水(制水仪Milli-Q IQ7000),HNO3为上海傲班科技有限公司生产(ICPMS PURE),实验中使用的碰撞氦气由北京顺安奇特气体有限公司生产,纯度99.999%;碰撞氢气由氢气发生器产生(ERRE Due,Mars 250DC),产气纯度99.9999%。

1.2 ICP-MS仪器条件

考虑到分析的样品与元素,会有35Cl16O+、43Ca16O+、40Ar16O+、23Na40Ar+、40Ar40Ar+等多原子离子产生的质谱干扰,使用碰撞反应池以消除多原子离子干扰,提高检测灵敏度与准确性。同时为了对比氢气和氦气对于质谱仪性能的影响,将ICP-MS仪同时接上氢气和氦气,使用仪器软件自动控制气路切换。

在碰撞模式中,通过调节碰撞气流速,使纯水中80Se的响应值低于1 000 cps,随后通入调谐液,调整碰撞反应池的出口电压、六极杆偏压以及聚焦透镜电压使质谱调谐液中的各元素响应值尽可能高。

仪器的主要参数以及通入碰撞反应池的氦气与氢气流量记录于表1中。

表1 仪器主要参数

1.3 质量数选择

测定元素质量数的选择,以该元素的最大丰度对应的质量数为原则,同时尽可能避免多原子离子和同量异位素造成质谱干扰。选定元素的同位素为51V、52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、72Ge、75As、80Se、114Cd、202Hg、205Tl、208Pb、209Bi。

1.4 灵敏度与检出限计算

仪器灵敏度通过测定前述16种元素的标准溶液后,将仪器响应值及其对应的溶液浓度计算线性回归方程,其中线性回归方程的斜率代表仪器灵敏度L。

测试11次试剂空白,计算仪器响应值的标准偏差S,并按以下公式计算检出限(Limit of detection,DL,ng/L)。

(1)

2 结果与讨论

2.1 通入碰撞气前后仪器性能对比

首先将仪器点火,按照仪器优化调谐方法将仪器状态调整至最优。检测通入碰撞气前(标准模式)的14种元素的响应值并按照公式(1)计算检出限,其中56Fe与80Se由于多原子离子干扰未进行检测,检出限(Limit of detection,DL)、线性回归方程(Linear regression equation,LRE)及其相关系数(Linear correlation coefficient,LCC)结果见表2。接着通过检测调谐液中Ce、CeO、Ba和Ba++的响应值,计算得到氧化物离子产率与双电荷离子产率分别为2.80%和2.64%,两项数值均满足《四极杆电感耦合等离子体质谱仪校准规范》(JJF 1159—2006)对两者的指标小于3.0 %的要求。

表2 标准模式下14种元素的灵敏度与检出限

接着将仪器切换至氦气碰撞模式,调整氦气流速使空白中的80Se背景响应值小于1 000 cps,按前述方法检测并计算包括56Fe和80Se在内的16种元素的灵敏度和检出限,记录于表3,计算出氧化物离子产率与双电荷离子产率分别为2.20%和2.75%。

表3 氦气模式下16种元素的灵敏度与检出限

最后将仪器切换至氢气碰撞模式,按前述方法经过调谐后并分析计算检出限(Limit of detection,DL)、定量限(Limit of quantitation,QL)、线性回归方程(Linear regression equation,LRE)及其相关系数(Linear correlation coefficient,LCC)记录于表4,三种模式下的氧化物离子产率与双电荷离子产率汇总记录于表5。

表4 氢气模式下16种元素的灵敏度、检出限和定量限

表5 三种模式下氧化物离子产率与双电荷离子产率

根据表2、3、4中的灵敏度数据,计算除56Fe和80Se外的各元素标准模式/碰撞模式灵敏度比值,结果绘制于图1中,结果表明氦气作为碰撞气的加入对各元素的灵敏度影响很大,最高会损失98.21%(51V),这是由于在调谐过程中,为了保证80Se的背景小于1 000而损失较多灵敏度,而氢气作为碰撞反应气时对灵敏度的损失则相对较小,最多损失74.03%(63Cu),同时氢气对某些同位素(66Zn、111Cd、202Hg、205Tl、208Pb和209Bi)的灵敏度有提升效果,说明在碰撞反应池中的选择性和准确性更高。

图1 氦气碰撞模式与氢气碰撞模式的灵敏度比值Figure 1 Sensitivity ratio of helium collision mode to hydrogen collision mode.

三种模式下14种元素的检出限比值结果绘制于图2中,结果表明即使有部分灵敏度损失,但是由于氦气或氢气的加入,均可以降低测试的14种元素的检出限,对于低浓度样品有更准确的检测结果。

图2 氦气碰撞模式与氢气碰撞模式的检出限比值Figure 2 Detection limit ratio of helium collision mode to hydrogen collision mode.

对于56Fe和80Se两种元素来说,在氢气模式的灵敏度比氦气模式分别高22和216倍,而检出限却分别是氦气模式的8.0%和24.5%。这是由于使用氦气和氢气时对干扰元素进行消除的机理不同造成的。氦气模式中,由于氦气自身稳定不能参与反应,对Ar等干扰元素的消除主要原理是碰撞发生能量转移,具有更大尺寸的多原子离子在碰撞时发生更大的能量转移,被去除的更彻底。离子束由于碰撞气的引入而发生碰撞聚焦效应[21],此时离子束通过一系列的碰撞行为损失径向和轴向能量,而径向能量的损失使离子在碰撞池中的运动更趋于电场中心,继而使碰撞池出口处的离子通过效率增加。随着碰撞气流速的增加,多原子离子逐渐下降,而当流速超过最佳水平时,碰撞反应池内的离子束会因与碰撞气的碰撞概率增加发生散射。仪器调谐的过程中不难发现,拥有更大质荷比的元素灵敏度的最大值对应的最佳碰撞反应气流速更大[22],这是由于较大质荷比的元素拥有更大的动能,需要更高的碰撞反应气流速。

氢气模式中,氢气可以通过反应选择性地去除Ar和其他等离子体基质离子[23],此时碰撞反应池内的Ar不仅会因为动能损失而减少,还可能有以下三种反应干扰消除的机制:

Ar++H2→ArH++H

(2)

ArH++H2→H3++Ar

(3)

Ar++H2→H2++Ar

(4)

以上三种机制包含氢原子转移[公式(2)]、质子转移[公式(3)]和电荷转移[公式(4)][24-25],这使干扰元素改变了质核比,可以在四极杆质量筛选器中轻松去除,增加信噪比。同时,与较重的氦气相比,使用氢气造成的分析物能量损失较低,从而具有更高灵敏度和更低的检出限通过对比氦气与氢气作为碰撞气的结果可以发现,相同仪器状态下,以氢气作为碰撞气时仪器的检测准确性、检出限以及灵敏度均优于氦气,后续将使用氢气作为碰撞反应气分析全血样本。

2.2 血液标准品和小鼠血液中16种元素的分析

使用三通引入在线内标溶液,以由0.1% HNO3和0.1% Triton X100稀释配制的16种元素的标准曲线作为外标,分析血液标准品样品(n=3),标准品的认证值、认证区间、测量值以及精密度结果列于表6中。同时将稀释后的小鼠血液样本分成两份,其中一份加入标准溶液分析计算加标回收率,结果列于表7中。

表6 Seronorm标准品的认证值、认证区间、测量值和仪器精密度

表7 Z143986、Z169538和Z750342血液样本分析结果

结果表明,对Seronorm 全血标准品中16种元素的分析准确度为86.0%～114%,仪器精密度为2.3%～4.8%。对小鼠血液样本中16种元素的加标回收率为81.2%～120%,符合血液样本的分析要求。

3 结论

本文讨论了氦气与氢气分别作为碰撞反应气时对ICP-MS性能影响的碰撞反应池机理,并提出一种使用氢气作为碰撞反应气,分析血液中16种元素(V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Se、Cd、Hg、Tl、Pb、Bi)的测试方法,该方法显著降低了干扰元素(40Ar16O+、40Ar40Ar+)在m/z=56和80的背景信号,同时该方法对比使用氦气时具有灵敏度高、检出限低的优点。使用该方法16种元素在0.5～100.0 μg/L线性关系良好(R2≥0.99991),全血标准品中分析准确度86.0%～114%,小鼠血液样本的加标回收率81.2%～115%,仪器精密度2.3%～4.8%,为血液金属组学分析提供了新方法。