人群重金属混合暴露与肝功能的关联研究

赵拴政 殷国桓 赵梅朵 李 昂 吴景涛 柳晓琳 魏岚萍 徐 晶* 许 群

(1.中国医学科学院 基础医学研究所,北京协和医学院 基础学院 流行病与卫生统计学系,中国医学科学院 环境与健康研究中心,北京 100005;2.锦州医科大学,辽宁 锦州 121001;3.锦州市中心医院,辽宁 锦州 121001)

肝病所致的全球疾病负担仍然巨大,据研究,全球每年约有200万人死于肝脏疾病,造成了严重的医疗经济损失[1]。同样,中国因肝病造成的寿命损失也有所上升[2]。研究表明,病菌、不良的生活习惯以及环境毒物等均可导致肝脏损伤,引发肝脏疾病[3]。肝脏作为人体的代谢器官,在对有毒化学物的代谢中起着关键作用[4]。而重金属作为一种广泛存在于土壤、水以及空气中的环境持久性以及生物累积性污染物[5],多项流行病学研究报道了其对肝脏的损伤[6-8]。然而,这些研究的结果是不一致的,且评估肝脏损伤的肝功能指标较为单一。因此,本研究选取辽宁省一个典型的重金属污染区居民作为研究对象,分析了5种重金属铬(Cr)、镉(Cd)、钒(V)、锰(Mn)、铅(Pb)与9种肝损伤标志物的关联。此外,考虑到真实的情况往往是多金属的共同暴露,本研究也同时评估了5种重金属混合暴露对肝功能标志物的总体效应。

1 实验部分

1.1 研究对象

研究对象来源于2016—2018年在辽宁省锦州市重金属污染区进行的横断面调查。纳入标准为:1)年龄≥18岁;2)在该地区居住10 a以上;3)无任何肝病,如脂肪肝、慢性肝炎或肝硬化;4)有完整的问卷和测量数据。本研究最终纳入1 266人,所有参与者均由专业人员进行标准化问卷的调查与体检,并收集了空腹血液样本。所有的参与者均签署了知情同意书,本研究方案(项目编号:2021025)已获中国医学科学院基础医学研究所机构伦理委员会批准。

1.2 调查内容

本研究通过标准化问卷进行调查,内容包括:年龄(连续型变量)、性别(男性或女性)、教育程度(小学及以下,初中及以上)、职业(农民或其他)、家庭年收入(<2 000元或≥2 000元)、吸烟状态(是或否)、饮酒状态(是或否)等。

1.2.2 体格检查

通过体格检查收集了参与者的体重、身高等信息,并计算了体质质量指数(Body mass index,BMI)=体重/身高2。

1.3 血液金属检测

空腹血样由临床专业人员在检查当天收集于无金属肝素抗凝管(BD Biosciences,CA,USA)中,并保存于-80 ℃冰箱中。采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS;Thermo Fisher X2;Thermo Fisher Scientific)来测量血液中Cr、Cd、V、Mn和Pb的水平。为便于进行后续的统计分析,对于金属水平低于检出限(Limit of detection,LOD),则以LOD/2替代。

1.4 肝功能标志物的检测

早期肝损伤生物标志物丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、天冬氨酸转氨酶与丙氨酸转氨酶之比(AST/ALT)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白蛋白与球蛋白之比(ALB/GLB)、总蛋白(TP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)使用自动生化分析仪(Hitachi 7600)检测。

1.5 质量控制

所有调查人员在调查开始前都接受了统一规范化的培训,调查数据也均采用双人录入,以确保一致性与准确性。血样金属的检测采用盲法和质控样本以确保检测质量。在分析样本之前,以空白溶液来确定背景值,进行加标回收实验,测试元素的峰值回收率在93.9%～102%,批内和批间的精度值分别为<5%和<10%。

1.6 统计学分析

分类变量数据采用数量(百分比)表示,连续型数据根据是否符合正态分布采用均数(标准差)或中位数[第一分位数(P25),第三分位数(P75)]表示。由于金属值的右偏态分布,本研究进行了对数转换以更好地拟合模型。此外,采用Spearman秩相关计算了5种金属之间的相关性。

王维说：“我心素已闲，清川澹如此。”所以，他能够领略自然中“明月松间照，清泉石上流”、“人闲桂花落，夜静春山空”的清幽空灵。

1.6.1 一般线性回归

首先以单个重金属浓度作为暴露变量,以每个肝功能生物标志物作为连续型结果变量,使用一般线性回归模型(General linear regression model,GLM)评估单一重金属暴露与肝功能生物标志物之间的关联。

1.6.2 加权分位数和回归

为了探讨5种重金属共同暴露对肝功能标志物的总体影响,以及每种金属在总体影响中的贡献占比,本研究使用了加权分位数和(Weighted quantile sum,WQS)回归,WQS模型用于评价混合物的总体效应及每个暴露变量重要程度。其默认假设所有暴露变量与结局关联为同一方向(正向或负向),当将WQS指数纳入多元回归模型时,相关效应估计代表总体混合效应,权重代表各金属在整体混合物中的相对贡献[9]。

1.6.3 Quantile g-computation

由于WQS模型需要预先确定相关的方向,当单一暴露和结果同时具有不同的相关方向时存在局限性,本研究同时使用了Quantile g-computation模型以弥补WQS模型关联方向选择的不足以及验证上述GLM与WQS的结果。Quantile g-computation模型不要求所有暴露都与结果均呈同一方向的相关。其可将金属浓度转换为四分位数,并拟合一个线性模型,从而得到总体效应,并同时输出每种金属在总体影响中的贡献占比[10]。如果5种金属的影响有不同的方向,其提供了每种金属的正或负权重值,正或负权重值之和为1或-1。

变量的描述性分析与GLM模型采用SAS 9.4(Cary,NC,USA)完成,WQS模型与Quantile g-computation模型使用了R(version 4.0.5)软件的“gWQS(version 3.0.4)”和 “qgcomp(version 2.10.1)”包。所有模型均对性别、年龄、BMI、教育程度、吸烟、饮酒状态、职业以及家庭年收入进行了调整。双侧检验P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况

1 266名研究对象的年龄为(65.5±10.5)岁,BMI为24.26±3.78,女性占比(64.6%)多于男性;多数人不吸烟(65.9%)或饮酒(73.2%),且职业多为农民(89.7%);教育程度多为小学及以下(92.7%),多数人(56.8%)家庭年收入≥2 000元。血液金属及肝功能标志物的浓度描述见表1。5种金属之间存在低到中度的相关性(0.04～0.29)。

表1 研究人群的基本特征(n=1 266)

2.2 单一金属与肝功能标志物的关系

由GLM的结果可知,经对数转换后的血重金属Cr、Cd、V、Mn的浓度每增加1个单位,AST/ALT水平分别平均升高1.59、2.86、11.83和5.28(βCr=1.59,95%CI:0.46、2.72;βCd=2.86,95%CI:1.30、4.42;βv=11.83,95%CI:7.87、15.78;βMn=5.28,95%CI:2.86、7.71);对数转换后的血重金属Cr、Cd、Mn、Pb水平每增加1个单位,ALB水平分别平均降低0.72、1.12、1.60和0.77 g/L(βCr=-0.72,95%CI:-1.04、-0.41;βCd=-1.12,95%CI:-1.56、-0.69;βMn=-1.60,95%CI:-2.28、-0.92;βPb=-0.77,95%CI:-1.44、-0.11);对数转换后的血重金属Cr、V水平每增加一个单位,GLB水平分别平均升高0.43和1.73 g/L(βCr=0.43,95%CI:0.21、0.65;βV=1.73,95%CI:0.95、2.50);对数转换后的血重金属Cr、Mn水平每增加1个单位,ALB/GLB水平平均降低1.42和1.48(βCr=-1.42,95%CI:-1.87、-0.97;βMn=-1.48,95%CI:-2.47、-0.50);经对数转换后的血重金属Cr、Cd、Mn、Pb水平每增加1个单位,TP水平平均降低0.32、1.17、1.48和0.81 g/L(βCr=-0.32,95%CI:-0.65、-0.01;βCd=-1.17,95%CI:-1.63、-0.72;βMn=-1.48,95%CI:-2.19、-0.77;βPb=-0.81,95%CI:-1.51、-0.12);经对数转换后的血重金属Cd、V、Mn水平每增加1个单位,TBIL水平分别平均升高0.59、2.70和1.01 μmol/L(βCd=0.59,95%CI:0.00、1.18;βV=2.70,95%CI:1.19、4.20;βMn=1.01,95%CI:0.09、1.94);经对数转换后的血重金属Cr、Cd、V、Mn、Pb水平每增加1个单位,DBIL水平分别平均升高0.08、0.07、0.13、0.10和0.06 μmol/L(βCr=0.08,95%CI:0.05、0.10;βCd=0.07,95%CI:0.04、0.11;βV=0.13,95%CI:0.04、0.22;βMn=0.10,95%CI:0.05、0.16;βPb=0.06,95%CI:0.01、0.12)。详见表2。

表2 一般线性回归模型中单一重金属与肝功能标志物的关联(n=1266)

2.3 混合金属暴露与肝功能标志物的关联及每种金属在混合效应中的贡献占比

2.3.1 加权分位数和(WQS)回归的结果

如图1所示,WQS指数每增加一个分位数,AST/ALT水平平均升高4.42(β=4.42,95%CI:2.66、6.18)、GLB水平平均升高0.52 g/L(β=0.52,95%CI:0.21、0.83)、TBIL水平平均升高1.33 μmol/L(β=1.33,95%CI:0.70、1.96)、DBIL水平平均升高0.31 μmol/L(β=0.31,95%CI:0.04、0.58),而ALB水平平均降低1.93 g/L(β=-1.93,95%CI:-2.54、-1.32)、ALB/GLB水平平均降低1.36(β=-1.36,95%CI:-1.99、-0.73)、TP水平平均降低1.47 g/L(β=-1.47,95%CI:-2.08、-0.86)。其中,V在金属混合暴露对AST/ALT(Weight=0.43)、GLB(Weight=0.52)、TBIL(Weight=0.48)的正向关联中有最大的权重,而Cr在对DBIL(Weight=0.34)的正向关联中权重最大。Mn、Cr、Cd分别在金属混合暴露对ALB(Weight=0.52)、ALB/GLB(Weight=0.58)、TP(Weight=0.47)的负向关联中权重最大。

图1 加权分位数和(WQS)回归中重金属混合暴露与肝功能标志物的关联及每种重金属的权重(n=1266)Figure 1 The association between mixed heavy metal exposure and liver function biomarkers in weighted quantile sum(WQS) regression and weights of each heavy metal(n=1266).

2.3.2 Quantile g-computation模型的结果

Quantile g-computation模型的结果基本一致于GLM与WQS的结果。如表3及图2所示,经对数转换后的5种重金属水平同时增加1个分位数,AST/ALT水平平均升高4.70(β=4.70,95%CI:2.86、6.55)、GLB水平平均升高0.32 g/L(β=0.32,95%CI:0.04、0.60)、TBIL水平平均升高0.97 μmol/L(β=0.97,95%CI:0.26、1.68)、DBIL水平平均升高0.23 μmol/L(β=0.23,95%CI:0.05、0.42),而ALB水平平均降低1.76 g/L(β=-1.76,95%CI:-2.29、-1.24)、TP水平平均降低1.41 g/L(β=-1.41,95%CI:-1.95、-0.87)。而Cr在混合金属对GLB(Weight=0.57)、ALB/GLB(Weight=-0.65)中有最大的权重;Cd在GLB(Weight=-0.73)、ALB/GLB(Weight=0.56)、TP(Weight=-0.41)中权重最大;V在AST/ALT(Weight=0.40)、TP(Weight=1)、TBIL(Weight=0.44)中权重最大;Mn在ALB(Weight=-0.34)、DBIL(Weight=0.43)中权重最大;而Pb分别在AST/ALT(Weight=-1)、TBIL(Weight=-0.55)中占有最大的负向权重。

图2 Quantile g-computation模型中每种金属在混合暴露与肝功能标志物关联中的权重Figure 2 Weights of each metal in combined effect on liver function biomarkers in the Quantile g-computation model.

表3 Quantile g-computation模型中重金属混合暴露与肝功能标志物的关联以及每种重金属的权重(n=1266)

3 讨论

本研究揭示了5种重金属(Cr、Cd、V、Mn、Pb)的单一和混合暴露与肝功能标志物(ALT、AST、AST/ALT、ALB、GLB、ALB/GLB、TP、TBIL、DBIL)之间的关联。结果表明,5种重金属混合暴露均能够影响肝功能标志物,且重金属V、Cr、Cd贡献占比最大。提示重金属暴露可能会造成肝脏损伤,V、Cr、Cd等可能对此影响最大。本研究为血金属与肝功能之间的关系提供了证据,具有重要的公共卫生意义。

肝功能指标检测可用于判断肝脏是否损伤,评估损伤程度,确定受损位置以及帮助鉴别诊断。当肝细胞受损时,ALT、AST被释放到细胞外,从而导致血清中水平升高[11];本研究观察到重金属与AST/ALT的正向关联,LI等[12]对2011-2018年的NHANES数据研究同样发现了重金属Cd与AST/ALT的正向关联,这与本研究的结果一致。TP、ALB由肝脏合成,当肝细胞受损时,二者水平下降[13];来自印度和巴基斯坦的两项Cr职业暴露人群的肝毒性研究报告显示,与对照组相比,Cr暴露人群的TP水平明显较低[14-15];此外,一项在中国人群中探讨Cd暴露对肝肾功能影响的横断面研究发现了Cd暴露与ALB水平的负向关联[16];最近的一项对中国浙江省807名一般人群进行的横断面研究表明,Cr与Pb暴露也均与TP、ALB水平呈负向关联[17]。同样,本研究也发现了重金属Cr、Pb、Cd等与TP、ALB的负向关联。GLB作为人体的一种血清蛋白,常被用于肝功能损害的敏感指标,诊断肝脏疾病[18]。而TBIL、DBIL通常用于鉴别肝胆疾病和溶血性疾病[19]。本研究发现了重金属与GLB、TBIL、DBIL存在正向关联。一项对NHANES数据的研究同样观察到重金属Pb与TBIL的正向关联[12]。然而,在中国浙江省开展的横断面研究观察到Cr、Pb分别与TBIL、DBIL呈负向关联[17],这与本研究观察到二者正向关联的结果不同,不一致的原因可能为:首先,前人研究采用的金属介质为尿液、而考虑到血金属更能反映体内的重金属负荷[20],本研究采用血液作为金属介质,生物介质的不同可能是结果不一致的主要原因;其次,前人研究选取的人群来源于中国国家人体生物监测中心的一般暴露人群,而本研究人群来源于重金属污染区,金属暴露水平的不同也可能导致结果的不同。此外,多项动物学研究同样观察到了重金属暴露与肝功能损伤的关联。对Wistar大鼠进行的几项重金属暴露实验发现,与对照组相比,Cr暴露组的TP水平下降[21]、Cd处理组ALB水平降低、Mn处理组的GLB水平显著升高[22]。

重金属广泛存在于环境中,且存在较长的半衰期[5]。机制学研究表明,重金属一旦被吸收,则会在肝、肾、骨骼等沉积,并通过氧化应激、DNA损伤等使人体造成严重损伤[23-24]。而当人体同时遭受多金属的共同暴露时,可能产生更为复杂的效应。两项关于小鼠的重金属混合暴露实验表明,小鼠同时暴露于Pb、Cd等金属,其血清ALT、AST水平显著高于对照及单金属处理组[25-26]。这提示我们更应该关注多金属的共同暴露。本研究发现多金属混合暴露与肝功能标志物ALB、TP呈负向关联,与TBIL、DBIL呈正向关联。此外,多项横断面研究同样观察到Cr、Cd、Pb等金属混合暴露与ALB、TP水平的负向关联,与TBIL、DBIL的正向关联[12,17,27]。这与本研究的结果一致。

4 结论

本研究拥有一些优势:1)采用了9种肝功能标志物来评价重金属对肝脏的影响,能更全面地评估肝脏损伤;2)探讨了5种金属对肝脏的影响,并同时使用了WQS与Quantile g-computation模型研究混合金属暴露对肝脏产生的总体效应,使结果更具可信性;3)本研究的金属来源于血液样本,其不受稀释度等因素的影响,检测的金属水平更为稳定。当然,本研究也存在一些局限性:1)研究为横断面研究,仅能提供关联的方向,而不能说明因果;2)研究虽针对许多因素进行了调整,但可能仍存在未收集的混杂因素,如饮食;3)本研究未区分金属的价态,例如Cr3+可能有益于人体,而Cr6+则是有害的。

综上所述,本研究为重金属与肝功能损伤之间的关系提供了证据,后续需进一步开展纵向研究来证明此种关联,这可能对识别肝病的非传统危险因素有重要意义。