毛蚶蛋白对益生菌抗生素胁迫的保护作用

梁铮洋，周苗，陶春霖，侯传丽，任娇艳

（华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510641）

水产品的抗生素残留可导致人体摄入后引起肠道菌群紊乱的问题。恩诺沙星是被报道在水产品中检出残留率最高的抗生素（超过11%）[1]，在局部地区检出率高达62.5%[2]。研究表明，该抗生素可引发肠道益生菌（双歧杆菌和乳酸杆菌）丰度下降，导致肠道菌群趋向抗生素耐药化，并削弱对病原菌的定植抗性[3]，且对大鼠保护性免疫的产生造成损害[4]。持续低剂量摄入恩诺沙星可导致病原菌对喹诺酮类抗生素（恩诺沙星、环丙沙星等）的耐药性，对人体和环境造成不可逆的影响[5]。

人摄入水产品抗生素残留可对肠道稳态造成破坏，但水产蛋白也对肠道益生菌有一定保护作用。蛋白质是食物重要的营养基质之一，前期研究发现，蛋白质及其消化道降解产物小分子肽等组分，对于肠道益生菌增殖及黏附具有重要促进作用[6]。鱼粉蛋白会上调小鼠盲肠中鼠李糖乳杆菌的丰度，影响肠道菌群中腐败化合物如丁酸盐和乳酸的产生[7]；鳓鱼蛋白替换培养基中的氮源可促进益生菌植物乳杆菌LP45 增殖，并辅助其在肠组织上黏附[6]。蛋白质对益生菌的作用机制可能包括提供必需氨基酸，提高益生菌的抗逆能力和促进益生菌蛋白酶、肽酶分泌的活性等[8]，这些研究表明水产蛋白在促进益生菌增殖，维持肠道微环境稳态方面具有巨大的潜力。

目前研究表明，毛蚶蛋白和多肽具有良好的生物活性。Guo 等[9]发现毛蚶蛋白ASP-3 对人肝癌细胞HepG2 具有较强的抑制作用，IC50值为(171.18±18.59) μg/mL；Chen 等[10]纯化出具有抗氧化活性的多肽H3，并通过电喷雾电离质谱仪分析出该多肽的117 个氨基酸序列；从毛蚶中鉴定出的多肽D2-G1S-1 和G2-G1S-2 在秀丽隐杆线虫上展现出延缓衰老的功效，并可缓解由百草枯诱导的氧化应激[11]。尽管对于毛蚶蛋白和多肽的生物活性已有了初步研究，其对人体肠道与益生菌的作用仍未明晰。

本研究基于恩诺沙星对四种益生菌的生长胁迫，建立了抗生素胁迫的益生菌生长模型，以红三鱼、黄蚬和毛蚶作为原料，经过低温超声辅助水提取制备三种水溶性蛋白粗提物，在模型中评价水产蛋白改善恩诺沙星对益生菌生长胁迫效果。在此基础上，对具有较高生物活性的毛蚶蛋白进行分离纯化，通过蛋白电泳分析每个组分的分子量分布，并对组分生物活性进行评价，为毛蚶蛋白的生物活性研究提供了新方向。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

红三鱼、黄蚬和毛蚶样品均从广州黄沙水产市场购买，4 ℃运输30 min，在-20 ℃保存。抗生素恩诺沙星购买自罗恩生物（上海），其余化学试剂均为分析纯。乳双歧杆菌Probio-M8、植物乳杆菌LP45、鼠李糖乳杆菌LGG 和两歧双歧杆菌BBi32 来自于本实验室，这些益生菌均于MRS 培养基上培养。酵母浸膏、牛肉浸膏，上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 培养基的配制

MRS 培养基的配方包括酵母浸膏5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、D-葡萄糖20 g/L、吐温80 1 mL/L、柠檬酸三铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸二氢钠2 g/L、硫酸锰0.02 g/L 和硫酸镁0.01 g/L。其中，葡萄糖与其余物质分开灭菌，灭菌并冷却后，于超净台内混合制成MRS 培养基。

依据Bradford 等[12]的方法测定样品中的蛋白含量，样品于超净台内过膜除菌后，按目标浓度调整样品添加量，用若干体积样品和无菌水将5×MRS 培养基稀释至正常浓度，即完成蛋白添加组培养基的配制。在各组实验中，抗生素恩诺沙星和蛋白样品的干预均于微生物开始生长前添加至基础MRS 培养基。

1.3 生长曲线的测定

使用酶标仪（Model SYNERGY H1，BioTek Instruments Co.Ltd.，Vermont，America）测定益生菌0～30 h 的生长曲线。以每孔200 μL 的量将培养液转移至96 孔板中，每个实验设置3 组平行，加完后置于酶标仪中，以连续振板方式培养并设置每10 min 记录600 nm 处的吸光值（OD600），培养30 h 后，统计数据并绘制生长曲线。下文中生长曲线的吸光值数据均为原始吸光值减去空白MRS 培养基的吸光值。

1.4 生长代时和曲线积分的计算

按照Liu 等[6]的方法计算生长代时和曲线积分。生长代时的计算：将所测得生长曲线的OD600值进行以自然对数转化，按1～5 h 的时间间隔分别在生长的1～20 h 内，进行线性拟合，筛选其中R2＞0.8 的回归方程。然后通过线性拟合的斜率计算生长代时，计算公式为：

式中：

g——生长代时；

k——斜率。

曲线积分的计算：首先将整个生长曲线与逻辑斯蒂方程（Logistic Equation）拟合，然后计算其积分面积。逻辑斯蒂方程如下所示：

式中：

N0——初始生物量（OD600）；

K——最大可能细菌数量（环境承载量）；

r——生长速率。

逻辑斯蒂方程将从生长曲线中拟合出K、r、N0的值。

1.5 粗蛋白的提取制备

毛蚶样品取斧足部肌肉，红杉鱼样品取背部肌肉，黄蚬取可食用部分作为原料样品。如图3a 所示，称取20 g 水产原料，剪碎后与60 mL 蒸馏水混合，在豆浆机（九阳，中国）中匀浆2 min，在4 ℃下超声辅助提取1 h，10 000 r/min 离心15 min，弃去沉淀，所得上清液即为样品中提取出的水溶性蛋白。

粗蛋白得率的计算：依据Bradford 等[12]的方法测定液体样品中的粗蛋白浓度，根据以下公式计算蛋白质得率：

式中：

Pc——粗蛋白得率，%；

C——粗蛋白样品质量浓度，mg/mL；

V——粗蛋白样品体积，mL；

m——原料质量，mg。

1.6 毛蚶蛋白的分离纯化

按照Chen 等[13]的方法，稍微进行修改，对毛蚶粗蛋白（CE）进行层析分离。调节粗提溶液pH 值至8.0，装入用Tris-HCl 缓冲液平衡两个柱体积的DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱。用相同缓冲液配制的0、0.1、0.3 和2 mol/L 的氯化钠逐步洗脱，每个浓度洗脱30 管，每管收集5 mL，流速为1 mL/min。依据Bradford 等[12]的测定每管蛋白质含量，并以此为依据收集组分。

纯化组分蛋白回收率的计算：依据Bradford 等[12]的方法测定每个试管样品粗蛋白浓度，根据以下公式计算纯化蛋白组分回收率：

式中：

Pp——纯化组分蛋白回收率，%；

m1——各组分蛋白质质量，mg；

m0——粗蛋白蛋白质量，mg。

1.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

用SDS-PAGE凝胶电泳分析毛蚶粗提物和各个组分的蛋白分子量分布情况。浓缩胶中聚丙烯酰胺的质量分数为5%，分离胶中聚丙烯酰胺的质量分数为12%。在电泳仪（Bio-Rad，美国）中以80 V 恒压电泳至溴酚蓝染色条靠近凝胶底端。电泳凝胶用考马斯亮蓝R-250 染色后分析。

1.8 数据分析

所有实验均重复三次，所有值都表示为平均值。使用Prism 8.0 软件进行统计分析。采用单向方差分析（ANOVA），使用Tukey 分析比较所有组之间的显著性差异。差异在P＜0.05 时被认为是显著的。

2 结果与讨论

2.1 恩诺沙星对不同益生菌的生长胁迫效应探究

恩诺沙星能抑制DNA解旋酶和DNA拓扑异构酶IV 的作用，阻止细菌的DNA 复制，起到抑菌的作用[14]。为了研究恩诺沙星对不同益生菌的生长胁迫作用，按照Wiegand 等[15]设计的方法，设置了从0.03 μg/mL 到1 024 μg/mL 的抗生素质量浓度梯度，图1 仅展示了能表现微生物生长状态明显差异的几个质量浓度。如图1 所示，当恩诺沙星的质量浓度为64 μg/mL 或更高时，所有微生物的生长均受明显抑制，相较于对照组（0 μg/mL）曲线积分显著下降（P＜0.001），且生长代时显著延长（P＜0.001）；而当抗生素的质量浓度为8 μg/mL 或更低时，四种益生菌的生长趋势均与对照组相近，于同一时间进入生长对数期，且生长代时未见显著变化，除Probio-M8 菌外，生长曲线积分未发生显著变化。由此可见，当抗生素质量浓度较高（≥64 μg/mL）或较低（≤8 μg/mL）时，四种益生菌对抗生素的反应差异不大。

图1 恩诺沙星对不同益生菌的生长胁迫效应Fig.1 Growth stress effect of enrofloxacin on different probiotics

图2 不同水产粗提蛋白的活性评价Fig.2 The activity of different aquatic crude extract proteins

当抗生素质量浓度为32 μg/mL 时，BBi32 菌生长受到抑制，OD600相较对照组（1.43）降低至0.52，且曲线积分显著降低（P＜0.005），生长代时相较于对照组略微延长，但不具有统计学意义；当质量浓度降低至16 μg/mL 时，该菌的生长代时未见显著变化，OD600上升至0.86，曲线积分提升至9.01，但与对照组仍存在显著差异（P＜0.05）（图1a）。

对于LGG 菌，32 μg/mL 抗生素可明显抑制其生长，生长延滞期延长至20 h 以上，在30 h 内未进入生长平台期，生长代时相较于对照组（1.28 h）显著延长至2.22 h；16 μg/mL 质量浓度下，该菌的生长受到轻微抑制，吸光值达0.97，低于对照组（1.62），曲线积分和生长代时均未发生显著变化（图1b）。

在32 μg/mL质量浓度下，LP45菌与LGG菌相似，生长延滞期被延长至20 h 以上，生长代时较对照组（1.52 h）被延长至2.22 h（P＜0.05），曲线积分显著降低（P＜0.001）；当恩诺沙星的质量浓度降至16 μg/mL 时，该菌的曲线积分显著降低（P＜0.005），在抗生素的影响下提前进入生长平台期，20 h后OD600维持在0.97，生长代时未见明显延长（图1c）。

对于Probio-M8 菌，在32 μg/mL 和16 μg/mL 的抗生素下生长延滞期受到不同程度的延长，吸光值均有所下降，曲线积分显著降低，生长代时相较于对照组（0.96 h）均显著延长（P＜0.01），分别为1.86 h 和1.43 h（图1d）。

上述实验结果表明，在这四种益生菌中乳双歧杆菌Probio-M8 对恩诺沙星最为敏感。之前的研究中，该抗生素对数十株双歧杆菌的最小抑菌浓度（MIC）分布在2～64 μg/mL[16]；当抗生素的质量浓度为12.5 μg/mL 时，体外培养的肠道菌群中乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度降低[3]。考虑到低浓度抗生素对益生菌带来的不利影响，用Probio-M8 菌分别在16 μg/mL 和32 μg/mL 恩诺沙星胁迫的生长模型对水产蛋白及其组分活性进行研究。

2.2 水产粗提蛋白的活性评价

红三鱼、黄蚬和毛蚶是三种常见的养殖水产品，也是人们经常摄入的几种水产品。利用Probio-M8 菌在32 μg/mL 的恩诺沙星胁迫下的生长模型对红三鱼、黄蚬和毛蚶粗提蛋白活性探究。红三鱼、黄蚬和毛蚶蛋白的粗提取得率分别为1.35%、0.27%、0.99%。如图3 所示，对照组为Probio-M8 菌在MRS 培养基中正常生长，模型组为该菌在有32 μg/mL 质量浓度恩诺沙星的MRS 培养基中生长，往含有该抗生素的培养基中分别添加0.1 g/L 和0.2 g/L 的不同水产蛋白对其进行活性评价。实验结果表明，当蛋白添加量为0.1 g/L时，三种蛋白粗提物均可提高曲线的OD600，其中毛蚶蛋白粗提物可将生长延滞期缩短至5 h 以内，且相较于模型组（2.48 h）显著降低生长代时至1.49 h（P＜0.05），展现出更好的生物活性。当蛋白添加量为0.2 g/L 时，毛蚶蛋白仍展现出良好的保护效果，相对于模型组，可将生长代时缩短至1.51 h。综合生长曲线、曲线积分及生长代时分析，三种水产品中毛蚶蛋白对益生菌的保护效果最优，其生物活性在0.1～0.2 g/L 范围内呈现剂量依赖性。

图3 水产蛋白的提取和毛蚶蛋白的分离纯化Fig.3 Extraction of aquatic proteins and isolation and purification of Arca subcrenata proteins

目前研究发现毛蚶蛋白的生物活性包括抗肿瘤[9]、抗氧化和金属结合能力[17]，其对益生菌的作用仍不明晰，上述实验结果表明，毛蚶蛋白可保护乳酸杆菌免受抗生素生长胁迫，具有调节肠道稳态的潜在功能。

2.3 毛蚶蛋白的分离纯化

毛蚶蛋白的纯化结果如图3b 所示，毛蚶蛋白粗提物在0、0.1、0.3 和2.0 mol/L 四个浓度的NaCl 通过阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow 中被洗脱出四个组分，分别为Fr0、Fr1、Fr2 和Fr3。Fr0、Fr1、Fr2、Fr3 的蛋白回收率分别为10.9%、4.03%、6.27%和1.54%。由SDS-PAGE 分析结果可知，粗提物的分子量主要分布在14.3～66.4 ku 之间，分别在35.0、23.0和14.3 ku 左右处观察到明显的条带。Fr0 的蛋白分子量分布在约14.3 ku 和43.0 ku 处，Fr1 的分子量分布于20.1～29.0 ku 之间，Fr2 的分子量分布较广，分布于14.3～97.2 ku，而Fr3 则集中于分布于小于14.3 ku 的范围。其中，Fr0 和Fr3 均在约14.3 ku 处有出现条带，而仅有Fr1 组分则在约23.0 ku 和27.0 ku 处出现明显条带（图3c）。上述结果表明，毛蚶蛋白的分离纯化效果良好，能明显区分组分之间的蛋白差异。

2.4 毛蚶蛋白组分的活性评价

将蛋白粗提物和纯化得到的组分以0.1 g/L 的质量浓度添加至含有16 μg/mL 恩诺沙星的MRS 培养基中，通过乳双歧杆菌Probio-M8 在该混合培养基中的生长状态对组分的活性进行评价。由图4 所示，所有蛋白组分均提高了培养体系的OD600。与模型组相比，除Fr2 组外，其余实验组的曲线积分均显著提高（P＜0.005），生长代时也均显著下降（P＜0.001）。其中，Fr0 可使益生菌的最大吸光值从模型组0.80 提升至1.56，提高生物量至接近对照组，相较于模型组显著提高曲线积分（P＜0.001）。Fr3 可使Probio-M8菌的生长代时恢复至0.98 h，与对照组接近。综合以上结果判断，毛蚶蛋白的组分均能缓解恩诺沙星对Probio-M8 的生长胁迫，其中Fr0 可显著提高培养体系中的细菌总数，Fr3 可显著降低益生菌的生长代时，具有良好的生物活性。

图4 毛蚶蛋白组分的活性评价Fig.4 Activity evaluation of protein fractions of Arca subcrenata

小分子蛋白和多肽是乳酸菌生长发育所依赖的主要氮源[8]，乳酸菌需通过分泌胞外蛋白酶将酪蛋白降解为寡肽，再对其吸收并利用[18]，有研究表明，大豆蛋白和多肽均能促进双歧杆菌的生长和代谢，且多肽的生物活性高于蛋白[19]。从SDS-PAGE 分析的结果可知，具有更高生物活性的Fr0 和Fr3 组分中含有更多小分子蛋白和多肽。相对于大分子蛋白，益生菌对小分子蛋白和多肽具有更高利用率，这可能是该组分具有更高生物活性的原因之一。

目前研究表明，不同肠段均存在肠道微生物，不同肠段所定植菌的数量和种类有所不同，其中结肠部分所含的菌数量最多，在蛋白质主要吸收的小肠部分也存在肠道微生物如乳酸菌和链球菌[20]。蛋白质进入人体胃肠后，大部分于胃消化在小肠吸收，仍有一些残留蛋白质能不被吸收而进入到结肠，并与肠道环境发生交互[21]。

3 结论

本研究基于恩诺沙星对四种益生菌抑菌作用差异，建立了乳双歧杆菌Probio-M8 在抗生素胁迫下的生长模型，在该模型下，毛蚶蛋白粗提物展示出保护益生菌免受抗生素生长胁迫的生物活性；毛蚶蛋白经分离纯化得到四个组分（Fr0、Fr1、Fr2 和Fr3），其中蛋白组分Fr0（14.3～43.0 ku）可将益生菌在抗生素胁迫下的OD600从0.80 提高至1.56，Fr3（＜14.3 ku）可将Probio-M8 菌的生长代时降低至0.98 h，缓解抗生素对益生菌的生长胁迫。综上所述，毛蚶蛋白组分可促进乳双歧杆菌在抗生素胁迫下增殖，表明毛蚶蛋白具有调节肠道稳态的功能，本研究为水产蛋白对肠道稳态的调节功能研究提供理论基础。后续研究将聚焦于优化毛蚶蛋白的提取工艺，提高活性蛋白得率，并利用生物酶水解毛蚶蛋白得到具有生物活性的多肽与寡肽，结合蛋白组学分析方法，优化可溶性蛋白的生物活性。