儿童Mowat-Wilson综合征的临床特点及基因变异和遗传情况

季文雅，郑必霞，张爱华

1 南京医科大学附属儿童医院儿科学重点实验室，南京 210008；2 南京医科大学附属儿童医院肾脏科

Mowat-Wilson综合征（MWS）是一种罕见的常染色体显性遗传病，由ZEB2 基因突变引起，患儿主要表现为特殊面容、智力发育落后、癫痫及先天性畸形［1］。ZEB2 为转录调控因子，在胚胎发育过程中起着重要的作用，因此MWS 表型可累及全身多个系统，包括神经系统、心血管系统、消化系统、眼部及泌尿生殖系统等，呈现高度异质性［1-3］。MWS 最早于1998 报道［4］，目前世界范围内已有400 例左右的病例，但其临床及遗传特点、长期预后尚未完全明确，给临床诊断和提供咨询造成了困难。本文回顾性分析了8 例MWS 患儿的临床资料，总结其临床特点，并了解本病的基因变异和遗传情况。

1 资料收集及全外显子基因组测序和分析

1.1 资料收集 回顾性分析2017 年1 月—2022 年12月在南京医科大学附属南京儿童医院就诊的8例MWS 患儿。通过医院电子病历系统获得患儿的病例资料，包括临床症状、体格检查、辅助检查等，随访患儿预后以及被临床医生忽略的表型。

1.2 全外显子基因组测序和分析 DNA 提取：患儿及其父母的外周血各2 mL，采用血液基因组柱式提取试剂盒（天根）提取外周血基因组DNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。全外显子基因组测序及Sanger测序验证：对患儿进行全外显子测序（WGS），筛选可疑的变异位点，利用Sanger法验证，同时对先证者父母进行共分离验证，测序及验证过程由北京全谱医学检验实验室完成。生物信息学分析：将得到的变异位点信息在各大数据库（HGMD、gnomAD、Pubmed、中国知网、万方医学网）查询。通过Mutation Taster 和PolyPhen-2 预测软件对基因变异危害性进行预测。借助Ensembl 数据库及Clustal Omega对突变位点蛋白质氨基酸的保守性进行分析。最后，按照美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）于2015年发布的序列变异解读标准和指南［5-6］，对遗传变异的致病性进行评级。

2 结果

2.1 8例患儿临床资料 ①患儿1：女，8月龄，因“8月龄不能翻身”于2019 年5 月21 日就诊，患儿不会翻身，系G2P3 足月产，为双胎之小，有母孕期保胎史。有新生儿缺血缺氧性脑病史、黄疸史，有“先天性巨结肠、先天性心脏病”手术史。查体：身长67 cm，眼距宽，外耳畸形，鼻梁低平，右侧耳前瘘管，肌张力稍高，双足外翻。诊断为“全面性发育迟缓”，建议定期体检，康复科随诊。电话随访，现患儿4岁，只会叫“ba ba、ma ma”，可以走路跑步上下楼梯，不会穿衣穿鞋。②患儿2：女，3 岁8 月龄，因“3 岁8月龄仅会喊人”于2019 年12 月10 日就诊，患儿走路稳，只会叫“ba ba、ma ma”。查体：眼距宽，喜伸舌，微笑面容，肌张力正常。目光交流时间尚可，呼之有回应，不会指物。有“先天性巨结肠”手术史。0～6岁小儿发育筛查量表示“DQ<59，MI<50，智龄12/9/9 月”。头颅磁共振示“两侧侧脑室旁终末带T2WI及FLAIR 序列信号略偏高”，诊断为“全面性发育迟缓”，建议定期康复训练。电话随访，目前患儿7岁2月龄，未上学，只会叫“ba ba、ma ma、nai nai”，能听指令，会上下楼梯，可穿衣穿鞋。③患儿3：女，1岁，因“发现运动认知落后1 年”于2020 年9 月10 日就诊，患儿竖头稳，独坐不稳，不能独站，无意识发“ba ba、ma ma”。母亲孕早期有先兆流产保胎3周病史。查体：眼距宽，鼻梁塌陷，鼻孔前倾，人中长，外耳大，快乐举止，有双足外翻，肌张力正常。查心脏彩超示“卵圆孔未闭”，头颅磁共振示“左侧侧脑室稍饱满，左颞部脑外间隙稍宽”，诊断为“全面性发育迟缓”，建议定期康复训练，康复科随诊。患儿定期于我院康复科评估发育情况并进行康复训练，卵圆孔未闭2 岁时自行闭合，病程中多次出现突发双眼凝视、口周流涎、呼之不应，每次持续1～2 min，请神经内科会诊，脑电图示“弥散性2～4 Hz 慢波背景，额、顶、枕、中后颢区为主多灶棘波、尖波、尖慢波发放，睡眠期广泛性2～4 Hz 尖慢波、（多）棘慢波发放，监测到清醒期1 次和睡眠期1 次孤立性痉挛及睡眠期1 次强直痉挛发作”，诊断为癫痫，予左乙拉西坦口服治疗。目前患儿3岁9月，可独走10步左右，无意识喊“ba ba、ma ma、nai nai”，不会指认五官，会欢迎再见动作，会伸手拿玩具。④患儿4：男，3 岁8 月龄，因“语言发育落后”于2021 年6月11日就诊，患儿不能说短句子，能喊人，能冒话，发单字或叠音为主，“ba，ma，nai”，约3 个字，不说短句，视听觉颜面反射欠灵敏。有新生儿败血症、新生儿肺炎，患儿母亲的二叔智力差，母亲第一胎16 周时流产，具体原因不详。查体：头前后径长，三角形尖下巴、眼距宽，耳垂隆起伴中心凹陷。心脏彩超示“房间隔缺损”，头颅磁共振未见明显异常。诊断为“言语和语言发育障碍，多动性障碍”，建议定期康复训练，未按时复查。电话随访，现患儿5 岁7 月龄，会喊“ba ba、ma ma、nai nai、ge ge”，能听指令，未上幼儿园，自己会走会跑，会上下楼梯，可以自己穿鞋穿衣服。⑤患儿5：男，7 月龄，于2021 年12 月29 日就诊，竖头不稳，不会翻身，拉坐一般，拇指内收，无主动抓握意识。有“先天性巨结肠手术”病史。查体：前额突，鼻根部凹，耳位低，俯卧抬头90°，拉坐头后仰，拇指内收，竖头不稳，不会抓物。儿童发育商检测量表示“发育商为52/50/43/65/62”，头颅磁共振提示脑发育不良，泌尿系B 超提示”左肾盂扩张”，心脏彩超示”动脉导管未闭、永存左上腔静脉”。诊断为“全面性发育迟缓”，建议加强大运动、精细运动训练，康复科就诊，定期康复训练，未按时随诊训练。⑥患儿6：男，2岁7月龄，因“反复抽搐6月余”于2022年9月22日就诊，患儿有反复抽搐发作，表现为双眼上翻、眨动，口周抖动，呼之不应，每次持续2～3分钟，每天2～3次，有摔倒2 次，发作时体温正常，发作后患儿无相关记忆。2 岁可独走，目前只会叫“ma ma”。查体：眼距宽、外耳畸形，高颚弓，喜笑，缺乏眼神对视，呼名不应，听理解欠佳，无法按要求指物，只会叫“ma ma”。患儿入院后完善相关检查，头颅磁共振示“两侧脑室饱满，左颞部脑外间隙增宽”。0～6 岁儿童发育量表示“DQ<50，MI<50”，孤独症ABC 量表测试示“CHAT 高度可疑，MCHAT 孤独症可疑组”。脑电图示“弥散性2～4 Hz 慢波背景，额、顶、枕、中后颢区为主多灶棘波、尖波、尖慢波发放，睡眠期广泛性2～4 Hz 尖慢波、（多）棘慢波发放，监测到清醒期1 次和睡眠期1 次孤立性痉挛及睡眠期1 次强直痉挛发作”。诊断为癫痫、孤独症、全面性发育迟缓。予德巴金口服治疗，康复科定期训练。电话随访，患儿目前3 岁3 月龄，只会叫“ma ma”，独走稳，癫痫控制不佳。⑦患儿7：女，1 岁，因“反复抽搐4 d”于2022 年5 月26 日就诊。患儿有反复抽搐，抽搐时无热，2～3 次每日，表现为双手握拳，双眼紧闭，肢体抽动，口唇发绀，头往后仰，持续3～4 s可自行缓解。既往因肛门狭窄行肛门成形术。患儿生长发育落后于同龄儿，家长诉患儿3月龄开始翻身，10月龄开始坐，现独坐不稳、不会爬，无意识发“nai nai”音。查头颅磁共振示“WI 序列左侧侧脑室前角旁白质异常信号、右侧大脑前动脉开窗畸形、右侧枕窦开放，右侧横窦较细”，儿童智力发育筛查量表示“运动智龄6月，社会适应智龄5月，智力智龄5月”，查心脏彩超示“卵圆孔未闭”。诊断为癫痫、全面性发育迟缓、卵圆孔未闭。予丙戊酸口服治疗，康复科随诊复查。电话随访，患儿目前2岁，癫痫持续未发作5 个月，卵圆孔未闭自然闭合，当地医院康复训练，不能独站，无意识喊“nai nai、ba ba、ma ma”。⑧患儿8：男，7 岁9 月，因“尿频伴蛋白尿7 月余”于2018 年8 月22 日就诊。病初患儿在“急性上呼吸道感染”后出现尿频，约1 次/小时，尿中有泡沫，尿色黄，至当地医院查尿沉渣提示“尿蛋白 + + + ”，24小时尿蛋白“1.89 g”，予“黄葵、保肾康”口服6个月，尿频症状无明显好转，尿蛋白持续 + + + ，2天前患儿尿频加剧，晨起有眼睑水肿。患儿生后即诊断为室间隔缺损，6 月龄时已行室间隔缺损修补术，出生时有缺氧病史，3 岁会走路，目前仅会说两字词语，不会成句，理解能力差，不能交流，否认其他病史。查体：体温36.8 ℃，脉搏92 次/分，呼吸25 次/分，血压110/75 mmHg，体质量27 kg，身高110 cm。双眼睑及双下肢轻度水肿，招风耳，左手通贯掌，双侧扁平足，阴茎短小，阴囊发育差，左侧睾丸活动度大。辅助检查：尿沉渣示尿蛋白 + + ，尿微量蛋白示尿微量白蛋白1 400 mg/L、尿lgG 72.10 mg/L、尿α1微球蛋白29.0 mg/L，24 小时尿蛋白1.55 g/L，尿白蛋白肌酐比值22 mg/g，双侧泌尿系B 超未见明显异常，肾静脉未见明显胡桃夹征象，肾脏穿刺病理活检示局灶节段性肾小球硬化（见图1B），韦氏智力测试IQ58 分。综合诊断：（1）慢性肾脏病（局灶节段性肾小球硬化）；（2）发育迟缓；（3）室间隔缺损术后。予口服环孢素、强的松及双嘧达莫治疗，居家检测尿蛋白，门诊随诊调药，患儿尿蛋白控制在“- + ～ + ”，激素按序减量，目前未再复诊。

图1 患儿4、患儿8变异位点（p.C1060Y、p.D654A）保守性分析结果及患儿8（p.D654A）的肾脏活检病理报告

2.2 8 例患儿基因变异和遗传情况 ①患儿1：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母基因组进行验证，结果显示患儿ZEB2基因上存在c. 2350_c. 2351insT（p. S784F*11）杂合移码变异，其父母均无该基因变异，为新生变异。该突变在之前文献中有过报道，且病例临床表型类似［7］。根据ACMG 指南，截断突变导致基因功能可能丧失，属于超强致病证据（PVS1）；在千人基因组数据库、EXAC 及ClinVar 等所有正常人群数据库频率<0.0005，为中等致病证据（PM2）；有可靠来源的数据库（HGMD）认为该变异为致病的，为可能致病证据（PP5）。综上，该变异初步判定为致病性变异（PVS1 + PM2 + PP5）。②患儿2：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母基因组进行验证，结果显示患儿ZEB2 基因上存在c.1150C>T（p.Q384*，831）杂合无义变异，其父母均无该基因变异，为新生变异。该变异在既往文献中有过报道［8］。根据ACMG 指南，无义突变导致基因功能可能丧失，属于超强致病证据（PVS1）；在所有正常人群数据库频率<0.000 5，为中等致病证据（PM2）；有可靠来源的数据库（HGMD）认为该变异为致病的，为可能致病证据（PP5）；两种统计方法（Mutation Taster、GERP）预测出变异对基因（基因产物）有影响，为可能致病证据（PP3）。综上，该变异初步判定为致病性变异（PVS1 + PM2 + PP5 + PP3）。③患儿3 和患儿6：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母基因组进行验证，结果显示患儿3 和患儿6 在ZEB2 基因均存在c.2073G>A（p.W691*，524）杂合无义变异，2例患儿父母均无该基因变异，该变异为新生变异，该突变在既往文献中有过报道［9］。根据ACMG 指南，无义突变导致基因功能可能丧失，属于超强致病证据（PVS1）；在所有正常人群数据库频率<0.000 5，为中等致病证据（PM2）；两种统计方法（Mutation-Taster、GERP）预测出变异对基因（基因产物）有影响，为可能致病证据（PP3）。综上，该变异初步判定为致病性变异（PVS1 + PM2 + PP3）。④患儿4：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母基因组进行验证，结果显示ZEB2 基因上存在c.3179G>A（p.C1060Y）杂合错义变异，其父母均无该基因变异，故为新生变异。检索Pubmed、HGMD 及万方等数据库未见文献报道，为新发现的1 个错义突变。借助Ensembl 数据库及Clustal Omega 对突变位点蛋白质氨基酸的保守性进行分析，显示该位点在多物种中均为半胱氨酸，高度保守（图1A）。根据ACMG 指南，错义变异位于非良性变异的关键功能域，为中等致病证据（PM1）；在所有正常人群数据库频率<0.000 5，为中等致病证据（PM2）；经家系验证分析，该变异为新生突变，为中等致病证据（PM6）；GnomAD 数据库中mis_Z score≥3.09 的基因上的突变，为支持致病证据（PP2）；经多种统计学方法（PolyPhen-2、Mutationtaster、PROVEAN、REVEL）预测出变异对基因（基因产物）有影响，为支持致病证据（PP3）。综上，该变异初步判定为可能致病突变（PM1 + PM2 + PM6 + PP2 + PP3）。⑤患儿5：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母基因组进行验证，结果显示ZEB2 基因上存在c. 904C>T（p. R302*，913）杂合无义变异，其父母均无该基因变异，故为新生变异。该变异在既往文献中有过报道［10］。根据ACMG 指南，无义突变导致基因功能可能丧失，属于超强致病证据（PVS1）；在所有正常人群数据库频率<0.000 5，为中等致病证据（PM2）；该变异在经家系验证为新生变异（PM6）。综上，该变异初步判定为致病性变异（PVS1 + PM2 + PM6）。⑥患儿7：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母进行验证，结果显示ZEB2基因上存在c.2467（exon8）C>T（p.Q823*，392）杂合无义变异，其父母均无该基因变异，故为新生变异。检索Pubmed、HGMD及万方等数据库未见文献报道，为新发现的1 个无义突变。根据ACMG 指南，无义变异导致基因功能可能丧失，属于超强致病证据（PVS1）；经双亲验证的新生变异，为强致病证据（PS2）；所有正常人群数据库频率<0.000 5，为中等致病证据（PM2）。综上，该变异初步判定为致病性变异（PVS1 + PS2 +PM2）。⑦患儿8：对患儿进行全外显子基因组测序，同时利用Sanger 测序对患儿父母基因组进行验证，结果显示ZEB2 基因上存在c. 1961A>C（p. D654A）杂合错义变异。借助Ensembl 数据库及Clustal Omega 对突变位点蛋白质氨基酸的保守性进行分析，显示该位点在多物种中均为天冬氨酸，高度保守（图1B）。检索Pubmed、HGMD 及万方等数据库未见文献报道，为新发现的1 个错义突变。根据ACMG 指南，在所有正常人群数据库频率<0.005，属于低频变异，为中等致病证据（PM2）；GnomAD 数据库中mis_Z score≥3.09 的基因上的突变，为支持致病证据（PP2）；经多种统计方法（PolyPhen-2、Mutationtaster、PROVEAN、REVEL）预测出变异对基因（基因产物）有影响，为支持致病证据（PP3）。该变异初步判定为临床意义未明变异（PM2 + PP2 + PP3）。

3 讨论

目前已报道的MWS患儿表型呈现高度异质性，但主要可以分为以下几个方面：①智力发育迟缓，以语言表达能力落后为主；②特殊面容，如耳垂隆起，鼻尖圆润，宽鼻根，眼距宽、尖下巴、喜张口、小头畸形；③癫痫；④矮小症；⑤多系统先天性发育畸形，如心血管系统发育畸形引起的先天性心脏病、胃肠道系统发育畸形引起的先天性巨结肠幽门狭窄、泌尿生殖系统发育异常引起的尿道下裂隐睾、肾脏异常、眼结构异常以及骨骼发育异常如唇腭裂等。本研究中的患儿6 慢性肾脏病表型之前无报道提及，MWS患儿肾脏异常以肾盂扩张肾积水、膀胱输尿管反流为主，除此之外还有盆腔肾、重复肾［1-2］。慢性肾脏病的单基因原因是近年来的研究热点，已证实有超过600 种基因突变与慢性肾脏病有关［11］，有文献［12］提出通过恢复ZEB2 的表达改善高血压患者肾脏预后的建议，指出了ZEB2 和肾脏病变的相关性，后有研究［13］进一步在小鼠层面证实ZEB2 突变可引起肾小球囊性肾病，本次研究中患儿6有慢性肾脏病，病理结果为局灶节段性肾小球硬化，故推测ZEB2 突变可能解释了患者的慢性肾脏病表型，但其明确相关性仍需进一步的研究证实。我们对6位患儿进行了随访，均仍处于发育迟缓状态，主要表现为语言发育迟缓，而语言理解能力和运动能力发育迟缓相对不明显，能听懂部分指令，穿衣穿鞋上下楼梯等生活自理能力可，均未能正常上学。这种发育迟缓的表现形式与之前报道的有关MWS 患儿发育迟缓表型特点相一致，目前已有研究随访到患儿可以通过上特殊学校获得教育［14］，这为MWS患儿的后期照护提供了一个新的思路。MWS 患儿目前共有的临床表型集中体现在智力发育迟缓和特殊面容，我们此次报道的8 例患儿均存在不同程度的智力发育落后和特殊面容，且5位患儿是因“智力发育落后”就诊，因此可将这智力发育落后作为临床诊断MWS 的重要突破口，但智力发育落后存在于多种基因病中，需要利用其特殊面容进行鉴别，并送全外显子基因测序以便早期明确诊断。

MWS 是一种罕见的常染色体显性遗传病，位于染色体2q22.3 上的ZEB2 基因是其致病基因，该基因编码ZEB2 蛋白，ZEB2 蛋白［15］属于锌指结合蛋白家族中的一种，功能域包括6 个：NIM（核小体质量构和去乙酰化酶相互作用基序）、N-ZF（n 端锌指簇）、SBD（smad 结合域）、HD（同源域）、CID（ctbp 相互作用域）和C-ZF（c 端锌指簇），发挥转录调控作用，表达广泛，参与调控细胞增殖分化和神经系统产生发育等重要生理过程［16-18］。已有研究［1］证实，ZEB2突变的致病机制是由单倍体剂量不足引起的，而无义突变以及移码突变可导致基因表达和功能的丧失。本研究中发现6 个无义突变和移码突变，根据ACMG 指南突变均使翻译提前终止，导致蛋白截断突变，支持这6个变异是致病变异。然而患儿4和患儿8 的错义突变则分别被评级为可能致病和临床意义未明的变异，基因的错义突变由于不直接造成蛋白截断突变，在缺乏实验数据时明确突变致病性一直较为困难［19-20］。患儿4 在ZEB2 基因上存在c.3179G>A（p.C1060Y）杂合错义变异，之前没有相同位点突变的患儿被报道，缺乏实验数据支持，但多种软件预测该突变对基因产物有影响，且通过借助Ensembl 数据库及Clustal Omega 对突变位点蛋白质氨基酸的保守性进行分析，显示该位点高度保守，全外显子测序显示该患儿在其他基因位点上未发现有害突变，且患儿有发育迟缓、典型的面容、房间隔缺损、注意缺陷多动障碍等典型表现，故考虑ZEB2 该位点的突变为致病病因。患儿8 在ZEB2 基因上存在c. 1961A>C（p. D654A）杂合错义变异，由于缺乏实验数据且无法获得家庭成员携带信息，故被评级为意义未明的变异。但突变位点氨基酸高度保守，多种软件预测该突变对基因产物有影响，追问家长得知家庭成员无相似表型，患儿有发育迟缓、特殊面容、室间隔缺损、小阴茎隐睾和慢性肾脏病等典型表现，全外显子基因检测显示其他位点无有害突变，故目前仍考虑ZEB2 突变导致患儿相关表型。结合上述8例患儿的临床表现及基因分析结果，我们认为8例患儿均患有ZEB2 导致的MWS，无义突变患儿诊断明确，错义突变患儿的明确诊断需要更多实验数据支持。

总之，WMS 患儿主要表现为智力发育迟缓、特殊面容、癫痫、矮小症及其他各系统的发育畸形等，需与其他造成智力发育迟缓的基因病相鉴别，对于有上述表现的患儿，应及时应用全外显子基因测序，以便早期诊断，如遇意义不明的新发错义突变必要时进行功能验证。WMS 患儿的慢性肾脏病表型为首次报道，但其明确相关性仍需进一步探究。同时本次随访数据还显示，MWS患儿智力发育迟缓以语言发育落后为主，可考虑通过早期接受特殊教育改善预后。