sPE 患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达变化及与产妇血管内皮损伤、围产儿结局的关系

张丽萍，李霞，谢艳

淮安市妇幼保健院产科，江苏淮安223002

重度子痫前期（sPE）是子痫前期的严重表现，累及多器官损害病变，可引起胎盘—胎儿并发症［1］。研究［2］表明，母体外周血管内皮损伤和功能障碍可引起高血压和多器官损伤，与sPE 病情进展有关。微小核糖核酸（miRNA）被证实可通过靶向信号通路相关基因调控免疫系统、血管生成和滋养层增殖和侵袭，参与PE 的发病进展［3］。微小核糖核酸-199a-5p（miR-199a-5p）是一种可靶向缺氧诱导因子-1，在妊娠期高血压和子痫前期患者血清中表达下调［4-5］。miR-142-3p 在sPE 中表达异常，被鉴定为子痫前期相关基因，并被证实可抑制蛋白激酶B（Akt）/内皮型一氧化氮合酶（eNOS）信号通路，促使血管内皮细胞凋亡和损伤［6-7］。上述研究标明，miR-199a-5p、miR-142-3p 表达异常可能与sPE 发病有关，但其与产妇血管内皮损伤和围产儿结局的关系尚不清楚。2020 年1 月—2022 年12 月，我们观察了sPE 患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达变化，并分析其与产妇血管内皮损伤、围产儿结局的关系，旨在为围产儿结局的改善提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年1月—2022年12月淮安市妇幼保健院收治的sPE 患者200 例（观察组），年龄25～40（34.41 ± 5.21）岁，孕次1～4（2.96 ±0.65）次，产次0～2（1.04 ± 0.21）次，孕周22～36（31.21 ± 3.41）周。纳入标准：①患者符合《妊娠期高血压疾病诊治指南（2015）》中sPE 的诊断标准［8］，初次确诊；②年龄≥18 周岁；③患者或家属书面知情同意本研究；④单胎妊娠。排除标准：①轻度、中度子痫前期；②胎儿染色体异常；③合并恶性肿瘤、严重肝肾疾病、心血管疾病、免疫疾病；④既往接受过妊娠期高血压相关治疗或口服可能影响本研究检测指标的药物；⑤患有妊娠期肝内胆汁淤积症、妊娠期糖尿病等并发症。另选择同期健康产检的孕妇200例（对照组），年龄22～38（34.12 ± 5.62）岁，孕次1～3（2.91 ± 0.58）次，产次0～2（1.02 ± 0.23）次，孕周21～36（31.21 ± 3.41）周。排除妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、胎盘早剥、子痫前期等妊娠期疾病。两组一般资料无统计学差异，具有可比性（P>0.05）。本研究已经获得淮安市妇幼保健院医学伦理委员会批准。

1.2 血清miR-199a-5p、miR-142-3p 检测 所有入选对象（观察组患者入组24 h 内，对照组孕妇产检当日）采集静脉血3 mL，注入干燥试管，室温下放置60 min，待血液凝固后取上层液离心（离心参数：3 000 r/min，离心半径10 cm，离心时间5 min），取上清液，分为三份，置于-80 ℃冰箱保存备检。采用血清RNA 提取试剂盒（美国赛默飞公司）分离总RNA，Nano Drop One 超微量分光光度计（美国赛默飞公司）测定总RNA 纯度，选取A260/280 吸光度值1.8～2.0 的RNA，采用Prime Script™II1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本TaKaRa公司）将总RNA 转录为cDNA。Step One Plus实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）系统（美国赛默飞公司）和TB Green®Advantage®qPCR Premix试剂盒（日本TaKaRa公司）进行实时定量荧光聚合酶连反应（RT-PCR）。引物序列：miR-199a-5p：5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3'，5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3'；miR-142-3p：5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'，5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；U6：5′-CGCTTCGGCA GCACATATACTA-3′，5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC3'。反应体系：TB Green®Advantage®qPCR Premix 2.5 μL，2 μL cDNA 特异引物，RNase-Free ddH2O 21 μL。反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，循环40次。以U6作为内源对照，2-ΔΔCt法计算miR-199a-5p、miR-142-3p。

1.3 血清血管内皮功能相关指标检测 所有入选对象（观察组患者入组24 h 内，对照组孕妇产检当日）采集静脉血3 mL，注入干燥试管，室温下放置60 min，待血液凝固后取上层液离心（离心参数：3 000 r/min，离心半径10 cm，离心时间5 min），取上清液。采用酶联免疫吸附试验检测观察组和对照组可溶性细胞内皮因子（sEng）、可溶性血管内皮生长因子受体-1（sFlt-1）、内皮素-1（ET-1）、血管内皮生长因子（VEGF），所有操作按试剂盒说明书进行。

1.4 围产儿不良结局危险因素及保护因素分析 根据围产儿结局将观察组分为结局不良组（29例，其中宫内生长受限10 例、胎儿宫内窘迫5 例、早产8例、新生儿窒息4例、新生儿死亡2例）和结局良好组（171 例）。利用本院的病历系统收集两组患者的临床资料，包括年龄、孕次、产次、孕周、sPE 类型（早发型、晚发型［8］）、并发症（视物模糊、水肿、子痫、心衰、肺水肿、腹水、胸腔积液、胎盘早剥、产后出血）、收缩压、舒张压等。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，采用独立样本t检验或校正t检验；计数资料采用χ2检验或校正χ2检验；Pearson 相关分析法分析观察组血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达与血管内皮功能相关指标水平的相关性；多因素Logistic 回归分析法分析sPE 患者围产儿结局不良的危险因素及保护因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组及对照组血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达和血管内皮功能相关指标水平比较 血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达和血管内皮功能相关指标水平比较见表1。

表1 观察组及对照组血清miR-199a-5p、miR-142-3p表达及血管内皮功能相关指标水平比较（± s）

表1 观察组及对照组血清miR-199a-5p、miR-142-3p表达及血管内皮功能相关指标水平比较（± s）

注：与对照组比较，*P<0.05。

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2.2 观察组血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达与血管内皮功能相关指标的关系 观察组血清miR-199a-5p表达与sEng、sFlt-1、ET-1水平呈负相关（r分别为-0.356、-0.427、-0.396，P均<0.05），与VEGF水平呈正相关（r为0.512，P<0.05）；血清miR-142-3p表达与sEng、sFlt-1、ET-1 水平呈正相关（r分别为0.327、0.411、0.377，P均<0.05），与VEGF 水平呈负相关（r为-0.498，P<0.05）。

2.3 观察组患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表达与围产儿结局的关系 根据围产儿结局将观察组分为结局不良组（29例，其中宫内生长受限10例、胎儿宫内窘迫5例、早产8例、新生儿窒息4例、新生儿死亡2例）和结局良好组（171例）。结局不良组年龄（36.12 ± 2.02）岁，孕次（3.02 ± 0.67）次，产次（1.12 ± 0.32）次，孕周（31.92 ± 3.21）周，早发型sPE 19 例（65.52%）、晚发型sPE 10 例（34.48%），并发症为视物模糊6 例（20.69%）、水肿12 例（41.38%）、子痫7例（24.14%）、心衰4例（13.79%）、肺水肿3 例（1.034%）、腹水5 例（17.24%）、胸腔积液2 例（6.90%）、胎盘早剥9 例（31.03%）、产后出血5 例（17.24%），收缩压（169.35 ± 5.12）mmHg，舒张压（116.35 ± 3.24）mmHg，血清miR-199a-5p 相对表达量1.69 ± 0.11，血清miR-142-3p 相对表达量5.02 ± 0.21；结局不良组年龄（34.12 ± 4.92）岁，孕次（2.95 ± 0.68）次，产次（1.03 ± 0.26）次，孕周（31.32 ± 2.94）周，早发型sPE 46例（26.90%）、晚发型sPE 125 例（73.10%），并发症为视物模糊30（17.54）、水肿31（18.13）、子痫12（7.02）、心衰25（14.62）、肺水肿20（11.70）、腹水32（18.71）、胸腔积液16（9.36）、胎盘早剥17（9.94）、产后出血10（5.85），收缩压（168.72 ± 4.09）mmHg，舒张压（115.56 ± 2.95）mmHg，血清miR-199a-5p 相对表达量2.06 ± 0.12，血清miR-142-3p 相对表达量4.24 ±0.53；两组年龄、早发型sPE 比例、并发水肿比例、并发子痫比例、并发胎盘早剥比例、并发产后出血比例、血清miR-142-3p 相对表达量、血清miR-199a-5p相对表达量比较，P均<0.05。以sPE 围产儿结局为因变量（赋值：0=结局良好，1=结局不良），以年龄、sPE 类型（赋值：0=晚发型，1=早发型）、并发水肿（赋值：0=否，1=是）、并发子痫（赋值：0=否，1=是）、并发胎盘早剥（赋值：0=否，1=是）、并发产后出血（赋值：0=否，1=是）、miR-199a-5p（连续性变量原值输入）、miR-142-3p（连续性变量原值输入）为自变量，纳入多因素Logistic 回归模型进行分析。结果显示，早发型sPE、胎盘早剥、miR-142-3p 高表达是sPE 围产儿结局不良的危险因素（P均<0.05），miR-199a-5p 高表达是sPE 围产儿结局不良的保护因素（P<0.05），详见表2。

表2 sPE患者围产儿结局不良的Logistic回归分析结果

3 讨论

sPE 是孕产妇围产期发病和死亡的主要原因之一，以不同程度的胎盘灌注不良为主要特征［1］。妊娠早期滋养细胞侵袭受损和螺旋动脉重构失败导致子宫胎盘血流量减少和胎盘应激，触发母体外周内皮细胞功能障碍，引起全身性炎症反应和以母体高血压为特征的sPE［2］。胎盘早期植入不良或发育不良促使滋养细胞释放抗血管生成分子，如sFlt-1、sEng，抗血管生成分子作用于母体血管内皮，刺激局部内皮释放血栓素、促炎细胞因子和氧化应激代谢物，加重全身内皮损伤。随着病情进展，导致胎盘早剥、胎儿宫内生长受限等围产儿不良结局。miRNA是长度约20 nt的非编码RNA，能特异性靶向并结合mRNA 的3′-UTR 区抑制mRNA 的翻译和表达，参与细胞代谢、免疫应答、细胞分化、疾病发展等多种病理生物学过程。研究［9］显示，多种miRNA 参与子痫前期的发病过程。

miR-199a-5p 是血管损伤相关miRNA，在妊娠期高血压患者中表达异常［10］。本研究显示，miR-199a-5p 在sPE 患者中表达降低，miR-199a-5p高表达是sPE 患者围产儿结局不良的保护因素。分析原因：首先，胎盘基底细胞粘附分子（BCAM）在滋养细胞膜上高度表达，激活磷脂酰肌醇-3 激酶调节亚基6（PIK3R6）/磷酸化转录信号转导子及激活子3（p-STAT3）信号通路，促使滋养细胞增殖、迁移和侵袭，引起胎盘不良和子痫前期样表型，包括收缩压升高、蛋白尿、多器官（胎盘、肝脏和肾脏）结构和功能受损以及胎儿生长受限［11-12］。miR-199a-5p可介导BCAM 降解，抑制PIK3R6/p-STAT3 信号通路，抑制滋养细胞增殖、迁移和侵袭，在sPE 中发挥保护作用机制［13］。其次，miR-199a-5p过表达可下调小窝蛋白1 的表达，降低人肾小球内皮细胞的通透性，缓解蛋白尿含量升高等子痫前期样表型［14］，进而降低不良围产儿结局的风险。本研究还显示，血清miR-199a-5p表达与血清sEng、sFlt-1、ET-1水平呈负相关，与VEGF 水平呈正相关，表明miR-199a-5p 可能参与sPE 血管损伤调控过程，miR-199a-5p 表达升高可能抑制抗血管生成分子合成，促使促血管生长因子表达，保护血管内皮功能，抑制sPE 的发展，从而降低围产儿结局不良的发生率。

miR-142-3p 可调控滋养层细胞增殖、迁移和侵袭，在妊娠期高血压患者中高表达，并且与子痫前期进展有关［15］。研究［16］发现，miR-142-3p 在子痫前期组织中表达上调，通过靶向抑制调控叉头框蛋白M1表达，抑制滋养细胞增殖，参与子痫前期发病过程。本研究显示，miR-142-3p 在sPE 患者中表达升高，miR-142-3p 高表达是sPE 患者围产儿结局不良的危险因素，提示miR-142-3p 过表达可能促使子痫前期病情进展和不良围产结局发生。分析可能的机制为：滋养细胞侵袭不足与子痫前期的发展有关，miR-142-3p 过表达抑制转化生长因子-β1/Smad3 信号通路，降低基质金属蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 的活性，继而抑制滋养细胞的侵袭和迁移，促使子痫前期病情进展［15］。本研究还显示，血清miR-142-3p 表达与血清sEng、sFlt-1、ET-1 水平呈正相关，与VEGF 水平呈负相关，表明miR-142-3p 可能通过调控血管损伤参与sPE 发病和进展过程。文献［17-18］报道，miR-142-3p 可通过微体进入内皮细胞，靶向上调BCLAF1，抑制内皮细胞增殖，促使内皮细胞凋亡，miR-142-3p 作为bcl-2 相关转录因子1 的下游基因，在其刺激下表达上调并诱导内皮细胞异常增殖，导致内皮细胞功能障碍。推测miR-142-3p 过表达可能抑制内皮细胞增殖，促使内皮细胞凋亡，导致血管内皮功能障碍和损伤，进而促使sPE 的发展，导致围产儿结局不良的发生。

本研究多因素Logistic 回归分析还显示，早发型sPE、胎盘早剥与sPE围产儿结局不良有关。分析原因为sPE 早期发病可能症状并不显著，导致就医延迟，由于病情进展迅速，易引起不良结局，胎盘早剥属于妊娠晚期严重并发症，可引起子宫持续收缩和胎儿心率改变，缺血缺氧，导致不良围产儿结局。刘颖等［19］也指出，早发型sPE 新生儿Apgar 评分≤7 分的发生率高于晚发型sPE，围产儿存活率低于晚发型sPE。廖琪等［20］认为，sPE 胎盘早剥易引起严重的孕产妇及围产儿结局不良。

总之，sPE 患者血清miR-199a-5p 表达降低、miR-142-3p 表达升高，与血管内皮损伤有关，miR-142-3p 高表达是sPE 围产儿结局不良的危险因素，miR-199a-5p 高表达是sPE 围产儿结局不良的保护因素。