马泡瓜中多酚的提取工艺及抗氧化性研究

张丽，郭靖，梁静静，刘雨欣

（衡水学院应用化学系，河北 衡水 053000）

马泡瓜是葫芦科黄瓜属的一年生匍匐草本植物，别称“马包”，属于中国的特有植物。马泡瓜果实内富含维生素E、维生素C、葫芦素C 等多种营养物质，具有极大的应用价值。研究发现，马泡瓜籽含有71.4%的多不饱和脂肪酸，含量远高于菜籽油、大豆油、花生油等日常食用油。马泡瓜籽油可通过调节肠道菌群来降低血浆胆固醇，研究表明，马泡瓜籽油具有抗氧化、抗真菌和抗炎活性，具有较大的开发潜力。然而，迄今为止关于马泡瓜的抗氧化活性的研究很少。因此，本实验为了实现马泡瓜的开发与利用，对马泡瓜中多酚的提取工艺及其抗氧化性能进行研究。

目前，提取植物中多酚的方法日益更新，性能不断提高，如溶剂提取法、生物酶提取法、超声波提取法等，对植物多酚的提取率也日益增加。超声波提取法具有方便、快速、简单、安全、易于实现工业化等优点。薛治浦等采用超声波辅助提取技术提取丹参叶总酚酸，通过单因素实验和Box-Behnken 实验设计以及响应面分析对提取工艺进行优化，得出较优工艺条件。本实验使用此方法研究马泡瓜总酚提取。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的复杂酚类次生代谢物，在自然界储量非常丰富。植物多酚的结构特点使其具有较强的抗氧化以及清除自由基的能力。多酚类物质是我们需要的天然抗氧化剂，但是人体自身不能合成，因此植物成为人类获取多酚的重要来源。本实验利用响应面法优化超声辅助提取马泡瓜中的多酚，为马泡瓜多酚开发提供了一条可行之径。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

马泡瓜采摘于河北省衡水市衡水湖附近；没食子酸、95%乙醇、福林酚原液、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、抗坏血酸、高锰酸钾，均为分析纯。

TD4 台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；BL6-180A 超声波清洗机，上海比朗仪器有限公司；722G 可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验内容

1.2.1 样品预处理

将马泡瓜粉末在干燥避光处保存备用。准确称取1.0 g马泡瓜粉末置于锥形瓶中，加入10 mL 60%的乙醇溶液作为提取溶剂，设置超声提取温度和超声提取时间分别为55℃和80 min。取少量提取液的上清液置于分光光度计中，760 nm处测其吸光值。

1.2.2 没食子酸标准曲线的测定

以没食子酸为标准品。用浓度为95%的乙醇溶液溶解没食子酸，取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8mL、1.0 mL 溶液分别置于5 支试管中，向每支试管中依次加入5 mL蒸馏水和0.7 mL福林酚原液，混合均匀，静置反应3 min，再向混合溶液中加入3 mL 7.5%碳酸钠溶液，最后用蒸馏水定容至10 mL，混合均匀后避光反应50 min。将溶液置于分光光度计中，760 nm 处测其吸光值。为了减小误差，进行三次平行试验。

利用Origin 软件对所测结果进行绘制，结果如图1所示。方程如式（1）所示：

图1 没食子酸标准曲线图

式中：x—没食子酸当量浓度，μg/mL；y—吸光值，L/（g·cm）。

1.2.3 马泡瓜多酚的单因素实验提取

取马泡瓜粉末1.000 0 g，液料比（mL/g）为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，乙醇浓度设为30%、40%、50%、60%、70%，超声提取，超声时间为60 min、70min、80 min、90 min、100 min，超声温度为35℃、45℃、55℃、65℃、75℃。超声提取结束后，分别吸取上层清液离心，吸取离心后的上层清液，在5 支试管中分别放置0.1 mL，向每支试管中加入5 mL 蒸馏水，再加0.7 mL福林酚原液，混合均匀后静置反应3 min，接着把3 mL 7.5%碳酸钠溶液加入混合溶液中，最后用蒸馏水使之定容至10 mL，混合均匀后避光反应50 min。将溶液置于分光光度计中，760 nm 处测其吸光值。为了减小误差，进行三次平行试验，并计算多酚的提取率。探究提取时间对马泡瓜多酚提取率的影响。

1.2.4 马泡瓜多酚含量的测定

采用福林酚法进行测定。依据吸光值，计算出马泡瓜中总酚的提取率。

式中：A—吸光值，L/（g·cm）；V—液体体积，mL；w—固体质量，g。

1.2.5 响应面实验设计

依据单因素实验结果，设计响应面实验，结果见表1。

自变量：提取时间（min）、液料比（mL/g）、乙醇浓度（%）、提取温度（℃）。

响应值：马泡瓜总酚的提取率（mg/g）。

1.2.6 马泡瓜多酚浸膏的制备

在1.2.5 响应面实验设计最优条件下，超声并取上清液进行离心，得到马泡瓜多酚溶液，再次离心，将溶液置于旋转蒸发器上进行旋蒸操作，从而得到马泡瓜多酚浸膏。

1.2.7 马泡瓜多酚的抗氧化性

根据一定比例稀释马泡瓜多酚浸膏，测定马泡瓜多酚溶液对DPPH的清除能力，与VC对DPPH的清除能力进行对比。

将马泡瓜提取的多酚浸膏溶解，配成不同浓度的马泡瓜多酚溶液，即浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、150 μg/mL、200μg/mL。

（1）取0.5 mL 马泡瓜多酚溶液，用稀释后的DPPH溶液定容至5.0 mL，反应30 min。

（2）取2.0 mL马泡瓜多酚溶液，加入2.0 mL无水乙醇，反应30 min。

（3）取2.0 mL 蒸馏水，并加入2.0 mL 的DPPH 溶液，反应30 min。

将溶液置于分光光度计中，测量吸光度Ai、Aj、Ao，为保证实验数据的准确，减小误差，进行三次平行实验。

以VC做对照组，将不同浓度的VC溶液代替马泡瓜多酚溶液，其余操作不变。

根据Ai、Aj、Ao求出多酚溶液对DPPH的清除率：

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果及分析

2.1.1 提取时间对马泡瓜多酚提取率的影响

由图2 可知，在一定条件下，马泡瓜多酚的提取率随着提取时间的增加，呈现先上升后下降的趋势。在80 min 时，提取率出现峰值，此时马泡瓜多酚的提取率最高。当提取时间从60 min 延长到80 min时，马泡瓜多酚的提取率呈现上升趋势；提取时间从80 min 延长到100 min 时，提取率则呈现下降趋势，分析原因可能是提取时间过长，使马泡瓜多酚发生分解，从而导致提取率降低，不能达到最好的提取效果。

图2 提取时间与马泡瓜多酚提取率的关系图

2.1.2 料液比对马泡瓜多酚提取率的影响

由图3 可知，在一定条件下，随着液料比的增加，马泡瓜多酚的提取率呈现先上升后缓慢下降的趋势。当液料比为30∶1（mL/g）时，提取率出现峰值，这时，马泡瓜多酚的提取率最高。当液料比从10∶1（mL/g）增大到30∶1（mL/g）时，马泡瓜多酚的提取率呈上升趋势；液料比从30∶1（mL/g）增大到50∶1（mL/g）时，提取率呈缓慢下降趋势，分析原因可能由于溶剂增多，使马泡瓜多酚被稀释，从而含量降低，提取率也随之降低。

图3 液料比与马泡瓜多酚提取率的关系图

2.1.3 乙醇浓度对马泡瓜多酚提取率的影响

由图4 可知，在一定条件下，可以明显看到随着乙醇浓度的增加，马泡瓜多酚的提取率呈现先上升后急剧下降的趋势。当乙醇浓度为50%时，提取率出现峰值，此时马泡瓜多酚的提取率最高。当乙醇浓度从30%提高至50%时，马泡瓜多酚的提取率呈上升趋势；乙醇浓度从50%提高至70%时，提取率呈急剧下降趋势，分析原因由于乙醇浓度的提高破坏了马泡瓜多酚的结构，从而使马泡瓜多酚的提取率急剧下降。

图4 乙醇浓度与马泡瓜多酚提取率的关系图

2.1.4 提取温度对马泡瓜多酚提取率的影响

由图5可知，在一定条件下，随着提取温度的升高，马泡瓜多酚提取率呈现先上升后下降的趋势。当提取温度从35℃提高到55℃时，马泡瓜多酚提取率呈上升趋势，继续升高提取温度至75℃时，马泡瓜多酚的提取率呈下降趋势。考虑到温度过高会破坏多酚结构，导致马泡瓜多酚变质，因此选用55℃为最佳提取条件。

图5 提取温度与马泡瓜多酚提取率的关系图

2.1.5 单因素小结

本实验探究了马泡瓜多酚的提取条件。实验表明，当提取时间、液料比、乙醇浓度和提取温度分别为80min、30∶1（mL/g）、50%、55℃时，马泡瓜总酚提取率最高。

2.2 响应面优化实验及统计分析

2.2.1 响应面Box-Behnken优化实验结果

根据单因素最佳提取条件，采用响应面软件，设计响应面优化实验，结果如表2。

表2 响应面Box-Behnken优化实验结果

将数据拟合，获得多酚提取率（Y）与提取时间（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）、提取温度（D）之间关系的二元多项回归方程：

Y=88.20+1.33B+2.5C+D-1.50AB-2.00AC-2.00AD-2.75BC -1.25BD -1.25CD -24.47A2-23.97B2-25.47C2-25.73D2

由表3可知，F=88.85，说明该模型显著，只有0.01%的概率使F 值出现这么大。P<0.05 说明该模型项显著。根据表3可知，C2、A2、B2、C2、D2是重要的模型项，多酚得率极其显著（p<0.05）。根据表3，马泡瓜总酚提取受四个因素影响程度：提取时间<提取温度<液料比<乙醇浓度。

表3 回归模型各项方差分析

2.2.2 响应面实验结果分析

由图6～图11 可知，通过模型的拟合分析，预测的最佳提取条件：提取时间、液料比、乙醇浓度、提取温度分别为81 min、31∶1（mL/g）、44%和59℃。进行三次平行实验，结果如表4 最佳工艺条件及其验证所示，得到平均提取率为79.042 mg/g，与预测值73.996 mg/g 相当，说明马泡瓜总酚提取条件可行、合理。

表4 最佳工艺条件及其验证

图6 提取时间和液料比对提取率影响关系图

图7 提取时间和乙醇浓度对提取率影响关系图

图8 提取时间和提取温度对提取率影响关系图

图9 液料比和乙醇浓度对提取率影响关系图

图10 液料比和提取温度对提取率影响关系图

图11 乙醇浓度和提取温度对提取率影响关系图

2.3 马泡瓜多酚的抗氧化性研究

由图12 可知，VC 对DPPH 的清除能力随溶液浓度的升高而增强，即溶液浓度从10 μg/mL 升高到200 μg/mL 时，清除率从46.59%上升至93.41%，上升了46.82%。马泡瓜多酚对DPPH 的清除能力随溶液浓度的升高先增强后减弱，即溶液浓度从10 μg/mL 升高到80 μg/mL 时，清除能力逐渐增强，抗氧化性增强，清除率从4.20%上升至27.87%，上升了23.67%。在80 μg/mL处达到峰值，清除率峰值为27.87%。当溶液浓度从80 μg/mL 升高到200 μg/mL 时，马泡瓜多酚对DPPH 的清除能力逐渐减弱，抗氧化性逐渐减弱，清除率从27.87%下降至14.53%，降低了13.34%。综上所述，VC对DPPH 的清除能力较高，而马泡瓜多酚对DPPH 的清除能力虽然弱于VC，但对其仍具有清除效果。

图12 总酚、VC对DPPH清除效果的测定

3 结论

本次研究通过单因素实验，确定提取时间、液料比、乙醇浓度和提取温度分别为80 min、30∶1（mL/g）、50%和55℃，此时，马泡瓜总酚提取率最大。

运用响应面模型的预测能力发现，马泡瓜总酚提取受四个因素影响程度为提取时间<提取温度<液料比<乙醇浓度，得到最佳提取条件：提取时间、液料比、乙醇浓度和提取温度分别为81 min、31∶1（mL/g）、44%和59℃，提取率为73.996 mg/g。

本文对比了马泡瓜多酚及VC 的抗氧化性，结果表明，马泡瓜多酚具有良好的抗氧化活性，活性随着浓度的增加先增大后降低；马泡瓜多酚对于DPPH的清除能力虽然弱于VC，但对其仍具有一定的清除能力。