薹用白菜品种细胞质雄性不育类型的分子鉴定

任志勇，聂启军，董斌峰，胡志伟，张俊红，王 坤，李金泉

（1.农业农村部高山蔬菜生态栽培重点实验室·蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室·湖北省农业科学院经济作物研究所 武汉 430064； 2.华中农业大学园艺林学学院 武汉 430070； 3.武汉大学生命科学学院 武汉 430072）

薹用白菜由十字花科芸薹种中以花薹为食用器官的变种或亚种组成，主要包括红菜薹（Brassica rapassp.chinensisvar.purpurea）、菜心（B.rapassp.parachinensis）以及白菜薹[1]。红菜薹是起源于长江流域的不结球白菜变种，茎叶呈紫红色，食用品质极佳，是湖北、湖南及四川等长江流域省份秋冬季节栽培的重要特色蔬菜[2]。菜心则起源于我国的华南地区，生长周期短，规模化种植基地遍布全国各地，可实现周年生产，已成为新兴的大宗叶菜类蔬菜[3]。白菜薹主要在我国南方地区的秋冬季节种植[4]，构成较为复杂，最早期的白菜薹是农民在长期种植过程中选择出来的一类具有早抽薹特性的弱冬性不结球白菜（B.rapassp.chinensis）品种，育种家则通过将不结球白菜与不需低温春化即可抽薹的菜心杂交，再进一步通过系统的自交选择获得的能够在年前抽薹的常规品种[5]。而当前市场上流行的白菜薹杂交品种则主要由不结球白菜与菜心杂交配组产生[6-7]。薹用白菜主要由幼嫩花薹为食用器官，不同类型又有所区别，其中红菜薹主要食用花蕾、薹茎，薹叶食用较少，菜心与白菜薹则三者均可食用。

与其他十字花科蔬菜一样，早期的薹用白菜杂交品种选育主要利用自交不亲和技术，然而自交不亲和技术生产杂交种成本较高，需要通过人工剥蕾繁殖制种亲本，杂交种纯度也受亲本自交不亲和性强弱的影响[8]。对于十字花科蔬菜而言，食用器官不是种子，利用细胞质雄性不育（CMS）选育杂交种时无需将父本改造为恢复系，只需创制出母本的不育系即可。因此，近年来一些在油菜中成熟使用的CMS 在薹用白菜杂交品种选育中也被广泛应用。PolimaCMS 是由华中农业大学从甘蓝型油菜中发现，并最早在油菜育种中成熟应用的CMS 类型，其不育性由orf 224基因控制[9]。PolimaCMS 已被转育到其他十字花科蔬菜如红菜薹、小白菜中，但该类型CMS 本身在甘蓝型油菜中便存在微粉的现象，其微粉程度在遗传背景变异较大的十字花科蔬菜中变得更不稳定，对其应用也产生了一定限制[10-11]。OguraCMS 也是在油菜中应用较为成功的CMS，败育彻底，最初在萝卜中发现并通过细胞工程手段导入到了油菜中，其不育性由orf 138基因控制[12-13]。已有的研究表明，OguraCMS 在转育到不同类型十字花科蔬菜如芥菜、白菜与甘蓝类蔬菜后，仍可保持败育彻底的特性，因此OguraCMS 也是现阶段在十字花科蔬菜中广泛应用的CMS 类型[14-16]。HauCMS 是在芥菜中发现的败育彻底型CMS，也是华中农业大学继PolimaCMS 后发现的另一个在油菜中具有应用价值的CMS 类型，其败育特性由orf 288基因控制，通过远缘杂交导入到油菜中后仍能保持败育彻底的特性[17]，目前该CMS 在菜心及白菜薹育种中已有成功应用的研究报道[18-19]。

现阶段Polima，Ogura与HauCMS 类型均已转育到薹用白菜中，与使用原始的不育源或油菜作为不育胞质供体相比，以已有的CMS 薹用白菜不育系及性状优良的CMS 杂交品种作为不育胞质供体可提高不育系的创制效率，如近年来新育成的白菜薹品种天成早薹1 号、菜心品种粤翠2 号及红菜薹品种申紫薹仙均是基于已有的薹用白菜不育系进行的母本不育系转育[7，20-21]。市场上同时存在不同类型的CMS 杂交品种，也为育种家创制不同类型CMS 杂交种提供了便利。然而一些CMS 类型的败育特征较为相似，如Ogura与HauCMS，在育种实践中笔者也发现已有的Polima分子标记无法将Polima与HauCMS 区分开。同时笔者也发现了一些具有特殊败育特征的薹用白菜商品种，然而由于多数商品种的来源与选育信息无法获取，现阶段需要特异性更强的CMS 类型鉴定分子标记，以实现对当前薹用白菜品种CMS 类型的精准鉴定。

基于以上问题，笔者对已报道在薹用白菜品种选育中使用的Polima、Ogura及HauCMS 进行序列分析，开发特异性分子标记，首先解决现有Polima分子标记在HauCMS 中的假阳性问题，进一步设计多重PCR 聚合分子标记，能够同时对3 种不育胞质与正常可育胞质进行检测，并利用开发的特异性标记对收集的薹用白菜CMS 类型进行鉴定。研究结果可为当前薹用白菜育种提供精准高效的CMS 鉴定分子标记，同时也可厘清当前薹用白菜育种中CMS 的应用特征。

1 材料与方法

1.1 材料

笔者前期通过武汉市大东门种子市场与湖北汉蔬创一农业科技有限公司收集了一批主流的红菜薹、白菜薹与菜心商品种以及处于初步示范阶段的杂交组合，于2021、2022 及2023 年的2-5 月份在湖北省农业科学院杨家堰试验基地内进行育性观察，将其中符合CMS 遗传特性即当代表现出不育特性、作母本与常规可育材料杂交后的F1代仍能保持不育特性的28 个品种/组合用于本试验（表1）。其中HCT1801 与BCT1815 为2 个特殊育性材料，二者大部分单株均败育彻底，但均存在少量不完全败育的单株。OguraCMS 对照材料紫御60、鄂红5 号与PolimaCMS 对照材料靓红70、鄂红2号均为湖北省农业科学院薹用蔬菜研究团队自主培育的红菜薹杂交品种。HauCMS 对照材料JC73A 由华中农业大学万正杰教授提供，Ogura恢复系对照材料由中国农业科学院油料作物研究所胡琼研究员提供，其他作为可育对照的材料均为湖北省农业科学院薹用蔬菜研究团队保存的种质资源与自交系。

表1 28 个CMS 薹用白菜品种/组合信息Table 1 Information of the twenty-eight flowering Chinese cabbage varieties

1.2 方法

1.2.1 不同CMS 类型序列特异性比对 将PolimaCMS、OguraCMS 及HauCMS 对应基因orf 224、orf 138及orf 288的基因序列分别与NCBI 数据库中的PolimaCMS、OguraCMS、HauCMS 的线粒体基因组序列（NCBI 登录号依次为FR715249，AB694744，KF736092）、白菜正常胞质的线粒体基因组序列（NC_016125）及核基因组序列（GCF_000309985）进行逐一比对，根据同源性序列的水平来评估3 个CMS 类型基因的特异性。其中基因与线粒体/核基因组间的比对利用NCBI 中的序列间Blast 功能完成，鉴定到高度同源的序列后，进一步使用EMBL-EBI 数据库中的MUSCLE 软件对同源性序列进行比对分析[22]。

1.2.2 特异性分子标记的设计 对于存在同源性序列干扰的CMS 基因，采取等位基因特异性PCR的策略[23]，在同源序列存在变异较大的区域设计引物，并通过在引物3’端引入碱基错配的方式提升引物扩增的特异性，初步完成标记设计后，使用不同类型的薹用白菜品种将新标记与该CMS 已有的标记进行检测效果比较，确定新标记的特异性。对于序列特异性较强的CMS 基因，直接以其序列为模板进行引物设计。为了开发具有共显性特征的CMS 类型鉴定分子标记，利用正常胞质与3 种类型CMS 胞质间的保守序列区域设计通用引物，保守区域通过mVISTA 比对软件进行鉴定和获取[24]。获得3 种CMS 类型的特异引物及与正常胞质间的通用引物后，将不同引物对混合在一起进行测试，根据扩增效果调整各引物对比例，获取最佳检测效果，最终得到可区分3 种CMS 及正常可育胞质的CMS 多重PCR 分子标记。在标记开发过程中引物设计相关的退火温度评估与二聚体分析均使用Oligo 7 软件完成[25]。

1.2.3 分子标记的检测 分子标记检测试验于2023 年8 月在蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室完成。

采用CTAB 法提取DNA，用ddH2O 溶解DNA，并将质量浓度调至100～400 ng·μL-1，用于PCR 扩增。10 μL PCR 反应体系为：1.0 μL 10 ×Easy Taq buffer，0.2 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Easy Taq 酶（5 U·μL-1，北京全式金生物），2.0 μL 待测样品DNA（100～400 ng·μL-1），单标记PCR 时加0.2 μL 正向与反向引物（10 μmol·L-1），多标记聚合PCR 引物用量则根据优化后各标记引物的浓度配比而定，最后加ddH2O 补足总体积至10 μL。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，单标记PCR 退火温度为55 ℃，时间30 s，多引物聚合PCR退火温度为58 ℃，时间30 s，72 ℃延伸45 s，共进行35 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，其中OguraCMS 恢复基因Rfo分子标记CIN6 的条带差异仅有8 bp[26]，采取4%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.4 不同类型薹用白菜CMS 基因型的检测 利用新开发的CMS 多重PCR 分子标记对收集的28个具有CMS 遗传特征的杂交品种/组合进行鉴定。对特殊育性材料HCT1801 与BCT1815 中的不完全败育单株的不育花、可育花及叶片分别进行检测，以确定CMS 类型，根据CMS 鉴定类型结果，进一步利用对应CMS 的恢复基因分子标记确定是否携带恢复基因。

2 结果与分析

2.1 特异性CMS分子标记的开发与验证

PolimaCMS 败育基因orf 224在HauCMS 线粒体基因组中比对到一段高度同源的序列，为了保证Polima分子标记的特异性，将其引物设计在orf 224与对应HauCMS 同源性序列中变异较大的区域（图1），并分别在正向引物3’端第6 位碱基和反向引物3’端第2 位碱基引入错配以提高扩增特异性（表2）。选取2 个已在育种中应用的Polima分子标记P1122、Pol_3132，与新开发的Polima分子标记进行特异性比较。结果表明，新设计的Polima标记在HauCMS 及其他测试的薹用白菜中均无假阳性（图2-C），而P1122 与Pol_3132 均在HauCMS 中出现假阳性结果，同时Pol_3132 还在部分红菜薹中出现弱阳性条带（图2-A～B）。OguraCMS 败育基因orf 138的序列特异性较高，在与其他类型胞质与正常胞质线粒体及核基因组进行比对后，均未鉴定到同源性较高的序列，因此直接以其序列模板进行引物设计。由于HauCMS 基因orf 288在各CMS 线粒体基因组及核基因组中均存在高度同源序列，因此用衡双平等[19]的方法从HauCMS 线粒体基因组中鉴定的特异性序列进行引物设计。通用引物则设计在PolimaCMS、HauCMS、OguraCMS 与正常胞质线粒体基因组的保守序列区域。为了兼顾多重PCR 的扩增效果，所有引物的设计模拟最适退火温度均为58～60 ℃，经过多轮的多重PCR 测试优化后，各CMS 类型的最佳引物浓度比例、序列及扩增目的条带大小信息见表2，将开发的多重PCR 分子标记命名为Brcms_M，Brcms_M 在不同的CMS 类型及正常胞质材料中均表现出良好的特异性（图2-D）。

图1 orf 224 与Hau CMS 中的同源性序列比对Fig.1 Sequence alignment of orf 224 and corresponding homologous sequence from Hau CMS

图2 CMS 多重PCR 分子标记Brcms_M 的特异性验证Fig.2 Specificity verification of the multiplex PCR CMS marker Brcms_M

表2 Brcms_M 标记信息Table 2 Information of marker Brcms_M

2.2 28个薹用白菜品种/组合CMS类型的检测

利用新开发的CMS 多重PCR 分子标记Brcms_M 对28 个薹用白菜CMS 不育品种/组合进行鉴定，结果显示除红菜薹HCT1801 与白菜薹BCT1815 为OguraCMS 外，其他不完全败育的品种均为PolimaCMS（图3，表1）。11 个红菜薹品种/组合中有8 个为PolimaCMS，3 个为OguraCMS，表明当前红菜薹CMS 杂交种仍以Polima类型为主。8 个白菜薹杂交品种/组合中仅有1 个为PolimaCMS，其他均为OguraCMS，9 个菜心CMS杂交品种/组合则均为Ogura类型，表明白菜薹与菜心杂交品种选育中Ogura为主要应用的CMS 类型。

图3 28 个薹用白菜品种/组合CMS 类型鉴定Fig.3 CMS type identification of the twenty-eight flowering Chinese cabbage varieties

2.3 特殊育性材料的CMS类型鉴定与分析

从湖北汉蔬创一农业科技有限公司收集的红菜薹杂交组合HCT1801 与白菜薹杂交组合BCT1815 均鉴定为OguraCMS 类型，但2 个组合中均存在不完全败育单株，这种单株在生长后期会同时存在不育花与可育花（图4-A～B）。使用Brcms_M 对不完全败育单株的不育花、可育花进行检测，结果表明，不育花与可育花的胞质也均为Ogura类型（图4-C）。利用OguraCMS 恢复基因Rfo的分子标记CIN6 对HCT1801 与BCT1815 的不完全败育单株进行鉴定，结果表明HCT1801 与BCT1815 的不完全败育单株均不含恢复基因Rfo（图4-D）。

图4 HCT1801 与BCT1815 不完全败育株的表型与基因型鉴定Fig.4 Phenotype and genotype identification of two partial sterility varieties HCT1801 and BCT1815

3 讨论与结论

薹用白菜是我国南方地区重要的十字花科蔬菜品类，其品种选育与其他十字花科蔬菜一样，主要经历了常规种、自交不亲和及CMS 杂交种3 个阶段。当前，十字花科的CMS 研究和育种应用均取得了较大进展，OguraCMS 败育彻底，在提高杂交种纯度及知识产权保护方面优势明显，近年来从国外引进的优良大白菜与甘蓝、青花菜品种中也以OguraCMS 型杂交种居多。笔者的研究结果表明，OguraCMS 也是当前薹用白菜育种中倾向于使用的类型，8 个白菜薹品种/组合中7 个均为OguraCMS 杂交种，而在薹用白菜杂交品种选育中起步较晚的菜心，则全部为OguraCMS 杂交种。红菜薹因早期杂交品种选育阶段PolimaCMS 应用较多，一些市场竞争力较强的Polima型杂交种仍然占据主导地位。HauCMS 相较于PolimaCMS、OguraCMS 发现较晚，虽然有报道其已应用于薹用白菜育种，但在笔者研究中收集的商业杂交种中未发现，可能与该类型在薹用白菜育种中的应用较晚，目前还未产生市场竞争力较强的品种有关。

在育种工作中，具有市场竞争力的CMS 商业杂交种实际上也被育种家视为重要的育种材料。在将亲本改造为不育系的过程中，育种家可直接利用已有的CMS 杂交品种作为不育源。而随着十字花科蔬菜恢复系材料创制工作的持续推进，通过对CMS 商业杂交品种进行育性转换，可直接利用这类品种中的优异特性如根肿病抗性[27-29]。对于薹用白菜而言，CMS 杂交品种的持续更迭使得不同CMS类型同时存在于市场中，这也与笔者的CMS 类型鉴定结果相契合。而在利用这些CMS 品种时，一个可以对CMS 类型进行精准、高效鉴定的分子标记显得尤为重要，笔者研究开发的CMS 多重PCR特异性分子标记Brcms_M 可对PolimaCMS、OguraCMS、HauCMS 及正常胞质同时进行鉴定。同时，相较于现有的Polima分子标记如P1122[30]、Pol_3132[31-32]，Brcms_M 也解决了因序列同源性较高而导致在HauCMS 材料中出现的假阳性问题。

笔者在收集的CMS 品种/组合中鉴定到了2 个特殊育性的OguraCMS 组合即红菜薹HCT1801与白菜薹BCT1815，2 个组合中均出现了部分可育单株，即在生长中后期同一单株上出现了可育花与不育花同时存在的现象。Brcms_M 鉴定结果表明这类单株的可育与不育花均为OguraCMS 类型。而已有的研究表明，OguraCMS 败育十分彻底，其败育基因orf 138早在花药发育的四分体时期即进行表达，进而引起线粒体发育异常，且此后花药绒毡层细胞的各个发育时期均不存在正常结构的线粒体[33]。OguraCMS 恢复基因Rfo表达的蛋白可结合在orf 138mRNA 的编码区，充当核糖体阻滞剂，阻碍沿orf 138mRNA 的翻译延伸从而解除orf 138的毒性，使育性恢复[13]，但笔者在2 个特殊育性组合HCT1801 与BCT1815 的部分可育株中均未检测到恢复基因Rfo。这种育性部分恢复的现象也有可能是线粒体中orf 138拷贝数变化引起的育性回复突变。已有的研究表明，CMS 材料受自身遗传背景的影响，细胞质线粒体中不育基因的拷贝数也会发生变化，从而产生育性回复突变体，但在自然条件下这种情况发生的概率极低，十字花科仅在芥菜CMS材料中报道其线粒体基因orf 220拷贝数变化导致的育性回复突变[34]。此外，HCT1801 与BCT1815中也可能存在能部分恢复OguraCMS 育性的新恢复基因，笔者也计划在下一步研究工作中将部分可育的单株花粉授到正常的OguraCMS 不育系上，观察其F1的育性特征来验证新的恢复基因是否存在。

综上所述，笔者开发了特异性多重PCR 分子标记Brcms_M，可对PolimaCMS、OguraCMS、HauCMS 及正常胞质同时进行精准鉴定，表明Polima是当前红菜薹育种中主要应用的CMS 类型，白菜薹与菜心CMS 则均以Ogura类型为主，同时发现2 个存在不完全败育现象且不含恢复基因Rfo的OguraCMS 组合HCT1801 与BCT1815。