温肾消水膏皮肤给药舒缓H22肝癌腹水瘤模型小鼠癌性腹水的作用机制研究※

李 阳 张洽淳 陈 蕾 纪意纯 钟 悦 王济国 冯婧宇 张 晶 黄国栋 莫潘艳

(1.广州中医药大学附属宝安中医院肿瘤科,广东 深圳 518100;2.广州中医药大学附属宝安中医院急诊科,广东 深圳 518100;3.广州中医药大学附属宝安中医院病理科,广东 深圳 518100;4.广州中医药大学附属宝安中医院中心实验室,广东 深圳 518100;5.四川省自贡市第一人民医院中医科,四川 自贡 643000)

癌性腹水是晚期恶性肿瘤常见的合并症,治疗困难,预后差,平均生存期是3～6个月。研究表明,中药外敷对癌性腹水有一定的作用,能改善腹胀、水肿等症状,提高生活质量[1]。中药外敷治疗癌性腹水以利水为核心,兼顾温阳、益气等,多用温阳化饮、利水消肿等药物,其缓解癌性腹水可能涉及抑制肿瘤生长、降低血管内皮生长因子(VEGF)水平等多种机制[2]。温肾消水膏由防己黄芪汤合真武汤加减而成,使用时将药物调成膏状,贴敷于腹部皮肤,有一定的改善腹胀症状、控制腹水的作用。本研究对H22肝癌腹水瘤模型小鼠予温肾消水膏腹部贴敷干预,观察其对癌性腹水的作用,以及对肾脏病理形态学的影响,探究对肾脏水通道蛋白1(AQP1)、AQP2、VEGF 等表达水平的调节,以分析温肾消水膏对癌性腹水的效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠10只,4～6周龄,雄性,体质量18～20 g,购自广东锐格生物科技有限公司,实验动物许可证号:SYXK(粤)2021-0059,饲养于SPF级动物实验室。饲养条件:室内温度20～26 ℃;日温差≤4 ℃,相对湿度40%～70%,昼夜明暗交替时间12 h/12 h。

1.2 药物和试剂

1.2.1 实验药物 温肾消水膏药物组成:制附子 9 g,黄芪10 g,茯苓10 g,赤芍10 g,白术10 g,生姜19 g,防己18 g,大腹皮10 g,甘草4 g,冰片10 g。由广州中医药大学附属宝安中医院中药应用中心将上述药物混匀后粉碎成细粉,过120目筛。用密封袋装袋,每袋50 g备用。使用时用清水调成膏状,贴敷于腹部皮肤。

1.2.2 试剂 H22细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司,货号:CL-0341);胎牛血清[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号:10099-141C];1640培养基[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,货号:C11875500BT];台盼蓝(北京索莱宝科技有限公司,货号:T8070);AQP1抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:AF5231);AQP2抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:DF7560);血管内皮生长因子A抗体(VEGF-A)(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:AF5131);肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:AF7014);β-actin 抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:AF7018);3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:AF7021);Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:S0001);全蛋白提取试剂盒(强)(北京索莱宝科技有限公司,货号:BC3710);彩虹245广谱蛋白Marker(11-245KD)(北京索莱宝科技有限公司,货号:PR1920);超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0018S);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE,上海信裕生物科技有限公司,货号:XY90008DY);牛血清白蛋白(BSA,上海麦克林生化科技股份有限公司,货号:B917420);聚偏二氟乙烯膜(PVDF,上海碧云天生物技术有限公司,货号:FFP19);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:Q711-02);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser[宝日医生物技术(北京)有限公司,货号:RR047A];QIAZol Lysis Reagent[凯杰企业管理(上海)有限公司,货号:79306],逆转录试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司,货号:RR047A],荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司,货号:RR820Q];苏木素-伊红(HE)染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G1003);马松(Masson)染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G1006);通用型组织固定液(武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G1101)。

1.3 实验仪器 H1650R型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);EPS-600型数显式稳压稳流电泳仪(上海天能生命科学有限公司);7500型荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技公司),K5800型微量核酸定量仪(北京凯奥科技发展有限公司);Donatello型脱水机(意大利迪佩斯公司);JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司);RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);JB-L5冻台(武汉俊杰电子有限公司);KD-P型组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);GFL-230型烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司);CRYOSTARNX50型冰冻切片机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];NIKON ECLIPSEE100型正置光学显微镜(日本尼康株式会社);NIKON DS-U3型成像系统(日本尼康株式会社);MB-530型酶标仪(深圳市汇松科技发展有限公司);CLM-170B-8-NF型CO2孵箱(新加坡艺思高科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模 将9只C57BL/6小鼠随机分为模型组、温肾消水膏组、空白组,每组3只,其中模型组、温肾消水膏组采用腹腔接种H22肝癌细胞悬液的方法建立H22肝癌腹水瘤小鼠模型,空白组不造模。将H22细胞快速解冻复苏,用1640培养液(含 10%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 U/mL)置于 37 ℃、5%CO2孵箱中培养,取对数生长期的细胞用1640培养液稀释,制成单细胞悬液,用 0.4%台盼蓝染色。计数活细胞数约为93%。用1640培养液将H22细胞稀释成 1×107/mL细胞悬液,取 0.5 mL接种于另1只C57BL/6 小鼠左下腹腔,将接种 8天后无菌抽取腹水,用1640培养液稀释悬浮肿瘤细胞并调整细胞浓度,按 0.2 mL/只(细胞数约15×106/只)接种于6只造模小鼠腹腔内。

1.4.2 给药 空白组及模型组不予药物干预;温肾消水膏组接瘤24 h后开始给药,腹部贴敷温肾消水膏,敷药范围1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm,用无纺布胶贴将药物固定于小鼠腹部,再用弹力绷带固定无纺布胶贴,每日1次,每次4 h,连续敷药10天。

1.5 观察指标及方法 第11天,各组小鼠乙醚麻醉后采用颈椎脱臼法处死。处死小鼠后,无菌条件下用注射器抽取小鼠腹水。解剖小鼠,摘取双侧肾脏,迅速放入液氮中-80 ℃保存。

1.5.1 腹水量及腹水瘤细胞计数的测定 处死小鼠后,无菌条件下用注射器抽取模型组和温肾消水膏组小鼠腹水,用注射器计量各小鼠腹水量。取上述腹腔积液(每只小鼠 0.5 mL)标本置于含肝素的干试管内,用0.9%氯化钠注射液稀释100倍,取稀释液 1 mL,用显微镜计数法计算肿瘤细胞数。

1.5.2 肾脏组织AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A表达水平的测定 ①采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测肾脏组织中AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A的蛋白表达水平,肾脏组织匀浆后提取总蛋白,加入SDS-PAGE后进行电泳,分离后进行转膜,用BSA封闭PVDF 1 h,然后洗脱5 min,孵育一抗:加入AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A一抗,4 ℃冷室孵育过夜。洗膜后加入二抗孵育,再次摇动洗涤,进行化学发光反应,然后浸入显影液中显色,最后凝胶成像,计算蛋白表达。②采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测肾脏组织中AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A的mRNA表达水平。提取肾脏组织于匀浆器中,加入QIAZol Lysis Reagent试剂提取总 RNA ,按逆转录试剂盒说明书要求,将提取的总 RNA 反转录成 cDNA,然后再进行扩增,以 GAPDH 为内参,采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。见表1。

表1 引物序列表

1.5.3 肾脏病理学观察 采用HE染色和Masson染色观察小鼠肾脏病理学组织。于第11天麻醉、处死各组小鼠,打开腹部暴露脏器,小心摘取肾脏,用0.9%氯化钠注射液充分冲洗后再用多聚甲醛固定,脱水,待石蜡完全浸入组织块后包埋,连续4 μm切片,分别进行HE染色和Masson染色,观察各组小鼠肾脏组织病理学变化。具体染色步骤如下:①HE染色:石蜡切片脱蜡后,冰冻切片复温固定,按HE染色套装使用说明先予苏木素染色,然后予伊红染色,中性树胶封片,显微镜镜检,图像采集分析。②Masson染色步骤大致同HE染色,按Masson染色套装说明进行染色。

2 结果

2.1 模型组与温肾消水膏组腹水量比较 与模型组比较,温肾消水膏组腹水量减少,但比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 模型组与温肾消水膏组腹水量比较

2.2 模型组与温肾消水膏组腹水瘤细胞计数比较 与模型组比较,温肾消水膏组腹水瘤细胞计数减少,但比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 模型组与温肾消水膏组腹水瘤细胞计数比较 个

2.3 各组小鼠肾脏组织AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A蛋白表达水平比较 与空白组比较,模型组、温肾消水膏组小鼠肾脏组织VEGF-A蛋白表达均降低(P<0.05),AQP1、AQP2、TNF-α蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,温肾消水膏组小鼠肾脏组织AQP1蛋白表达升高(P<0.05),AQP2、TNF-α、VEGF-A蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4,图1。

空白组编号:1～3;模型组编号:4～6;温肾消水膏组编号: 7～9

表4 各组小鼠肾脏组织AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A蛋白表达水平比较

2.4 各组小鼠肾脏组织AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A mRNA表达水平比较 与空白组比较,模型组、温肾消水膏组肾脏VEGF-A mRNA表达均降低(P<0.05),AQP1、AQP2、TNF-α mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,温肾消水膏组小鼠肾脏组织 AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组小鼠肾脏组织AQP1、AQP2、TNF-α、VEGF-A mRNA表达水平比较

2.5 各组小鼠肾脏病理学观察

2.5.1 HE染色结果 与空白组比较,温肾消水膏组、模型组小鼠肾小球系膜区增宽,系膜细胞增生,肾小管变性,部分区域肾小球萎缩,肾间质有炎性细胞浸润;与模型组比较,温肾消水膏组小鼠肾间质炎性细胞浸润情况较少,系膜细胞增生减少。见图2。

图2 各组小鼠肾脏组织病理学变化(HE,×200)

2.5.2 Masson染色结果 与空白组比较,模型组、温肾消水膏组有大量胶原纤维沉积于肾小球系膜区;与模型组比较,温肾消水膏组胶原纤维较少。见图3。

图3 各组小鼠肾脏组织病理学变化(Masson,×200)

3 讨论

癌性腹水成因复杂,对患者生活质量影响大,治疗棘手。癌性腹水的形成机制复杂,其内科治疗主要包括利尿、补充白蛋白、全身抗肿瘤治疗等,局部治疗包括有腹腔穿刺置管引流、腹腔热灌注治疗,腹腔注射化疗药物、抗血管生成药物、细胞因子药物等。

癌性腹水属中医学“鼓胀”范畴,系因肝、脾、肾三脏受损,气、血、水瘀积腹内而成,治疗原则包括益气、温阳、化瘀、利水。温肾消水膏由真武汤合防己黄芪汤加减而成,方中制附子辛热,能温壮肾阳,散寒止痛;黄芪补气健脾补肺,能固表行水;生姜温胃散寒行水,制附子、黄芪与生姜相伍,温阳益气,发散水气。茯苓淡渗利水;白术苦甘而温,健脾燥湿;赤芍活血祛瘀利水;防己苦泄辛散,祛风除湿,利水消肿;大腹皮利水宽中,行气消胀;冰片利于药物经皮肤吸收。诸药合用,起到温阳利水的作用。研究表明,防己黄芪汤和真武汤均具有抗肾间质纤维化、改善肾功能的作用[3-4];真武汤能改善慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型肾脏病理变化[5-7],对肾阳虚水肿有治疗功效且能明显改善肾功能[8],能上调阿霉素肾病大鼠肾组织AQP1、AQP2蛋白表达水平,改善其肾脏病理[9],对体外人肾小管上皮细胞(HK-2)氧化损伤模型具有明显的保护作用,有抗肾纤维化及肾小管上皮转分化作用[10]。

肾脏AQP1和AQP2主要转运水分子,AQP1主要表达在肾近曲小管的上皮细胞和髓袢降支细段上皮细胞胞质,以及肾小球毛细血管内皮细胞胞质[11]。AQP1缺失导致近曲小管和亨利袢降支细段的渗透性及重吸收能力降低,逆流倍增系统遭破坏[12]。病理情况下可引起AQP2总量或顶膜表达减少[13]。本研究结果显示,温肾消水膏有上调肾脏 AQP1、AQP2的趋势,有助于促进腹水的吸收。VEGF是促进血管新生最主要的因子,其作用于内皮细胞,促进血管的通透性增加,致使血浆和血浆蛋白从血管中渗透,外渗的纤维连接蛋白等成分形成纤维网络,为新生血管的形成提供基础。持续的血管新生和新生血管渗透性增加促进了癌性腹水的形成。VEGF同时也是引起慢性肾衰竭肾损伤的重要因子,VEGF可促使上皮细胞形成血管环,进而影响肾小球的滤过功能,VEGF的过度表达可引起慢性肾衰竭蛋白尿[14]。下调慢性肾衰竭模型大鼠肾脏组织中VEGF基因及蛋白表达,大鼠慢性肾衰竭的情况好转,肾脏组织中肾小球硬化及炎性细胞浸润的情况改善[15]。本研究结果示,与模型组比较,温肾消水膏有调节肾脏VEGF接近空白组的趋势。下调VEGF的表达,一是减少了血管新生,从而减少癌性腹水的形成,二是有利于肾功能的改善,从而保障尿液排出,利尿消肿,有助于癌性腹水的控制。经检验,使用温肾消水膏后的小鼠腹水量有减少的趋势。通过肾脏形态学分析提示,与模型组对比,温肾消水膏减轻了肾间质炎性,减少肾小球系膜细胞增生,改善了肾脏病理。

综上所述,温肾消水膏能舒缓癌性腹水,其作用机制可能与上调肾脏 AQP1、AQP2,下调肾脏VEGF,改善肾脏病理有关。提示临床上对癌性腹水的控制,可以从多角度着手,改善肾功能,抑制瘤生成,可能取得较理想的结果。

本研究肾脏病理阅片得到广州中医药大学附属宝安中医院病理科高琳媛主治医师会诊,在此特别致谢!