中草药联合用药对水产养殖病菌防控及微生态的影响

陈 静

（江西省医药技师学院，南昌 330200）

密集型养殖模式的应用以及水质环境的不断恶化使得水产养殖疾病频发，无形之中使得抗生素等防治药物的用量与病菌环境之间形成恶性循环［1］。抗生素和消毒剂类化学药物会导致病菌产生多重耐药性，对水生环境和人们的身体健康造成较大的隐患［2］。微生物防治、网箱养殖、细菌制剂等手段多被运用在水产养殖病菌防治中，但这些防治手段受限于养殖规模和环境条件因素，且菌群抑制作用不稳定，难以发挥长久有效的功效［3］。而中草药作为一种天然药物，其本身的低残留性以及对药源性疾病传播的根绝性，使其在水产养殖中多被运用在哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌等的抑制作用上［4］。中草药本身所含有的营养物质元素也能提高水生动物的免疫力，多位学者也曾借助中草药提取物对水生病菌的抑制作用进行了探究［5-7］。不同中草药的病菌抑制作用不尽相同，鉴于此，对中草药联合用药在水产养殖中的抑菌作用进行探究，并以微生物种群结构变化对其效果进行佐证，以期为中草药联合用药在水产养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同中草药含有的成分及药物疗效各不相同，故先对传统中草药进行初步筛选，再对抑菌作用强的中草药进行配比组合试验。从某鱼类养殖场中取一定量的水样，对水样中提取出的常见致病病原体进行无菌分离鉴定，得到嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、嗜盐菌（Bibrio parahemolyticus）、假单胞菌（Pseudomonas adaceae）、枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）［8］，上述5 种致病菌分别标记为细菌A-细菌E。表1 为致病菌培养基，表2 为中草药信息，中草药购于某药房，药材均为干燥状态。

表1 致病菌培养基

表2 中草药信息

1.2 中草药提取物的制备

对所选中草药分别称取50 g 置于烘箱中于60 ℃烘干，将烘干后的固态中草药与烘干后研磨成粉的中草药按照1∶1 的比例混合置于烧瓶中，在烧瓶中加入500 mL 去离子水，混合物静置浸泡3 h。随后对浸泡液进行文火煎煮，反复3 次，每次1 min。最后将3 次煎煮的药液过滤和加热浓缩，高温灭菌后置于低温保存备用。联合用药的制备方法同上。

1.3 病菌的培养和药敏片的制备

将细菌分别划线LB 平板上，并在28 ℃恒温培养箱中培养24 h，将单菌落接种于无菌LB 培养基中，借助麦氏比浊仪对培养且清洗后的菌苔液进行密度测定。调适后的菌苔液置于试管中保存用于后续的试验操作［9］。对无菌滤纸进行药液浸泡后烘干保存，则完成药敏片的制备。

1.4 试验方案

1.4.1 抑菌试验 将“1.3”中制备的100 μL 菌悬液均匀涂抹于LB 平板上，随后将药敏片贴于琼脂表面，观察恒温培养下的抑菌圈大小。抑菌圈直径（Inhibitory circle，IC）的大小能反映药物浓度的变化和药物敏感性［10］。每种药物均进行3 次重复试验，最后取3 次试验的平均值。根据不同中草药呈现出的抑菌圈直径大小进行效果差异值划分，以10 mm为基线标准，在此基础上每增加5 mm，则其抑菌作用提升一个等级。“-”为无敏感，抑菌圈直径小于10 mm；“+”为弱敏感，抑菌圈直径10～15 mm；“++”为中等敏感，抑菌圈直径15～20 mm；“+++”为较强敏感，抑菌圈直径20～25 mm；“++++”为强敏感，抑菌圈直径大于25 mm。

以最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）对抑菌作用进行数据量化处理，其数值大小与药效作用的强弱呈反比，即MIC、MBC越小则呈现出的抑菌圈越大［11］。并借助二倍稀释法进行抑菌试验结果测试，从测试结果中选择抑菌作用较强的药物并将其分别置于10 mL 的试管中，按照不同浓度编号，另外再设置一组阳性对照和一组阴性对照（阳性对照为只加药液的空白对照，阴性对照只加菌液不加药液）。将菌液接种至相应的试管中，接种量均为100 μL，观察28 ℃培养24 h 后菌群的变化情况，假如试管中为透明状态，则表明无细菌生长，那么该浓度即为最小抑菌浓度。

1.4.2 微生物种群试验 为对中草药联合用药在水产养殖中微生物种群结构的影响进行分析，研究借助高通量测序技术进行数据处理。在Miseq 高通量测序平台利用测序技术对药物敏感性强的联合用药在微生物种群结构上的影响进行分析，对每组的测定数据取平均值，从DNA 提取、数据测序、OUT 聚类分析等几个方面对结果进行评定。

1）样品采集。以某水养殖系统为试验场地，设置适宜的恒温环境条件，将水养殖系统分为对照（对照组为中草药单一用药）和3 个试验组，3 个试验组为筛选出的具有强抑菌作用的中草药联合用药组。各处理分别加入对应的中草药混合液，使得水体最小抑菌浓度始终保持在30 mg/mL。取相同体积的水样涂至培养基上，每3 d 统计1 次细菌数量，共统计6 次处理。

2）测序技术步骤。在养殖系统中分别在对照组和处理组养殖水中取出0.5 L 的水体混合搅匀后进行DNA 提取，提取试剂盒为Foregene 试剂盒。DNA处理和测序由江苏华冠生物技术股份有限公司进行。依据测序结果对样本进行OUT 聚类分析（Operational Taxonomic Units），对具有97%相似度的序列指数进行分析，能较好地分析群落结构的差异性。

2 结果与分析

2.1 中草药的筛选

对中草药的抑菌作用进行分析，结果如图1 所示。图1 结果表明，所选用的中草药均有不同程度的抑菌作用，其中Co 对细菌B 的抑菌圈直径最大，Mu、Gr 和Co 均对细菌B 有较好的抑菌效果，IC值分别为16.14、18.12 和26.83 mm，对5 种致病菌的总体抑菌效果较好的是Mu、Gr、Co、Pu。故在之后的中草药联合用药中对这4 种进行分析。

2.2 中草药联合用药的抑菌效果和耐药性分析

2.2.1 抑菌效果 对Mu、Gr、Co、Pu 药材进行配比，分析其联合用药对致病菌的抑制作用。从表3 可以看出，不同中草药联合用药所呈现出的抑菌效果各有不同，从抑菌圈直径来看，“Mu+Pu”组合对5 种细菌的整体抑菌作用最大，其IC值在细菌A-D 上均在10.00 mm 以上，整体平均抑菌圈直径达13.23 mm；其次“Mu+Gr”组合和“Mu+Co”组合所表现出的药物敏感性虽稍差于“Mu+Pu”组合，但其IC 平均值仍然达到了11.69 mm和11.44 mm。而“Gr+Pu”和“Co+Pu”组合仅在细菌A 和B 上表现出较好的抑菌效果，其整体IC值较低。从MBC值来看，“Mu+Gr”“Mu+Co”“Mu+Pu”“Gr+Co”“Gr+Pu”“Co+Pu”6 种中草药 配 比方案对5 种细菌的MBC最小值分别为7.80、25.68、7.81、62.38、25.68、26.11 mg/mL。“Mu+Gr”组合对细菌A、B 和D 的MIC均值为7.85 mg/mL，“Mu+Pu”组合对细菌C、D、E 的MIC均值为7.82 mg/mL，同时结合图2 发现，将抑菌效果较好的乌梅和川连与其他中草药联合后，其所表现的抑菌效果没有明显的提升。上述结果表明，“Mu+Gr”组合、“Mu+Co”组合、“Mu+Pu”组合以及“Gr+Co”组合具有较好的菌群控制作用，且其药物敏感性较强。

表3 中草药联合用药下的致病菌MIC 和MBC 变化情况

2.2.2 耐药性 图2 是对细菌A 的耐药性分析，细菌在不同中草药联合用药下的数据变化差异明显，其中“Mu+Gr”组合下，细菌A 的MIC和MBC分别为3.7、4.3 mg/mL 时可以有效抑制病菌的生长，“Mu+Co”和“Mu+Pu”组合中细菌A 的整体MIC和MBC数据下降态势稍劣于“Mu+Gr”组合，但“Mu+Co”组合和“Mu+Pu”组合在药物浓度最低为5.5 mg/mL 和0.115 mg/mL 时可以抑制病菌数量，“Mu+Pu”组合表现最优。而“Gr+Co”组合MIC的最大值与最小值之间差异显著（P＜0.05），表现出一定的耐药性，应用推广性受限，故在后期的微生物多样性分析上不对该配比方案进行探讨。

2.3 联合用药下的细菌差异性和微生物种群分析

2.3.1 水体微生物分析 高通量测序技术下的多样性分析是借助Alpha 指数和稀释曲线反映特定生态环境下的微生物丰富性和多样性情况，对试验数据进行收集整理后，绘制成图3。图3 中有3 个处理组（为上文中提到的“Mu+Gr”组、“Mu+Co”组以及“Mu+Pu”组，此处标记为试验组1、2、3），每个处理组中包括两个平行对照组。不同处理组中的样品细菌丰度有所差异，因此在稀释曲线时进行比较。图3a 中的不同水体样本以覆盖情况进行序列分析，结果表明，水体的采样数值在后期逐渐趋于平稳，基本不表现出增加态势且整体表现出较好的序列量，可以进行后续的微生物检验分析。且对照组样本的序列量明显多于其他组别，结合图3b 结果分析，发现对照组两个样本Ace 指数和Shannon 指数均高于其他组别。而在中草药联合用药下的3 个试验组的两个指数值均较低，且试验组1 所包含的细菌种数相对较少，不同水体样本中的细菌总数存在一定的差异性。

图3 不同水体样品的稀释曲线和指数变化情况

2.3.2 样本水体细菌丰度变化情况 对样本水体中的细菌群落情况进行分析，从图4 可以看出，4 个组别下不同属类的细菌占比均有所不同，且存在部分细菌种属消失情况，对照组较试验组中的致病菌变化幅度情况超过5%。样本水体中的微生物结构表现出一定程度的差异性，且3 种中草药联合用药所表现的抑菌作用明显。

图4 不同水体样本中的细菌丰度变化情况

2.3.3 样本水体细菌差异性比较 以多元统计分析对水体样本的逐渐差异情况进行分析，并以细菌总数和物种检测数量为指标进行比较，将数据绘制成表，其结果如表4 所示。试验干预前，对照组和投入中草药的试验组在基线数据上没有太大的变化。而随试验干预时间的延长，添加中草药联合用药的组合细菌总数显著下降，且其数据与对照组相比以及与前一时间点数据相比差异显著（P＜0.05）。同时“Mu+Gr”组合、“Mu+Co”组合和“Mu+Pu”组合的细菌丰度减少率分别为28.16%、25.33%和13.27%，其中“Mu+Gr”组抑菌效果最显著。

表4 样本水体细菌的差异性比较

3 小结

可持续发展理论理念的提出以及对绿色养殖模式的尝试创新使得越来越多的人开始关注到水产养殖可持续的重要性，也逐渐有意识地引入不同的药物制剂对致病菌进行防治控制。研究提出以中草药联合用药来探究其对微生物及致病菌的影响机制，结果表明，Mu、Gr、Co、Pu 4 种中草药联合用药对5种致病菌具有不同程度的抑制作用，其中“Mu+Gr”组合、“Mu+Co”组合和“Mu+Pu”组合所达到的平均抑菌圈直径分别为11.69、11.44、13.23 mm，且药物敏感性较强；同时“Mu+Gr”组合下的病原菌MIC和MBC在最低药物浓度为3.7 mg/mL 和4.3 mg/mL 时可以有效抑制病菌，但“Gr+Co”组合表现出一定的耐药性（P＜0.05）。试验结果表明，乌梅与川连、石榴皮以及白头翁进行配比时具有较好的抑菌作用，其配比用量需要根据不同水生环境以及气温变化等因素的影响进行调整，加强对中草药联合用药的应用可实践性是今后研究的主要改进方面。