甲状腺结节良恶性的分子分型研究

李浩榕， 韩如来， 郁丹燕， 叶 蕾

（上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科 上海市内分泌代谢病研究所国家代谢性疾病临床医学研究中心（上海） 国家卫健委内分泌代谢病重点实验室上海市内分泌肿瘤重点实验室，上海 200025）

甲状腺结节（thyroid nodules）是指甲状腺内可触及的或在超声检查中与周边甲状腺组织回声不同的病灶。 绝大多数甲状腺结节为良性，仅有少数最终诊断为恶性结节， 即甲状腺癌 （thyroid cancer）。 甲状腺癌按分化水平分为分化型甲状腺癌、低分化癌和未分化癌。分化型甲状腺癌整体预后较好， 甲状腺乳头状癌 （papillary thyroid carcinoma，PTC）是其最常见的类型，也是最常见的甲状腺癌病理类型，占全部甲状腺癌的85%～90%[1]。 而低分化癌和未分化癌患者预后差。绝大部分穿刺细胞学良性的甲状腺结节不会恶变[2]。因此，甲状腺结节的良恶性鉴别和甲状腺癌的风险分层非常重要。

分子分型可协助甲状腺结节良恶性鉴别和甲状腺癌的风险分层。甲状腺癌的驱动基因主要涉及丝裂原激活的蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-AKT 通路， 肿瘤进展与端粒酶逆转录酶 （telomerase reverse transcriptase,TERT）、TP53、PIK3CA和AKT1等基因的突变累积相关[3-5]。 2022 年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）更新了甲状腺肿瘤分类，对滤泡起源的恶性肿瘤根据分子特征和侵袭性进行了分类，分为BRAF类（BRAF-like）和RAS类（RASlike）[1]。BRAF类为经典乳头状形态，MAPK 信号通路高水平激活；RAS类多为滤泡性包裹性生长模式，MAPK 信号通路低水平激活。 目前许多RAS类的PTC 被重新分类于恶性伴有乳头状核特征的非浸润性滤泡肿瘤和恶性潜能未定的高分化肿瘤。甲状腺良性结节特有Zeste 同源物增强子1（enhancer of Zeste homolog 1，EZH1）、 斑点型BTB/POZ 蛋白（speckle type BTB/POZ protein,SPOP）、 锌指蛋白148（zinc finger protein 148，ZNF148）基因突变，占比20%左右， 与甲状腺癌基因组突变类型不同，两者遗传进化路径迥异，具有独立起源[6]。 另外，促甲状腺激素 （thyroid stimulating hormone，TSH） 受体（TSH receptor，TSHR）和GNAS变异可引起甲状腺高功能腺瘤； 甲状腺激素合成通路胚系基因突变，可导致结节性甲状腺肿形成[7-8]。

二代靶向测序技术可对目标基因区域进行靶向高通量测序， 可实现测序范围的个性化定制，并且极大节约测序成本。上海交通大学医学院附属瑞金医院（瑞金医院）内分泌团队自建甲结Panel, 可完成112 个基因的靶向检测，包括甲状腺良性结节相关基因、甲状腺癌相关基因、甲状腺发育和功能相关基因、 细胞来源鉴定基因和内参基因5 类基因。 可检测目的基因的碱基替换、插入缺失、拷贝数变异和融合突变以及基因表达水平。

本研究拟对甲状腺结节进行分子分型，开展甲状腺良恶性结节的分子分型研究。

材料与方法

一、样本采集

纳入2009 年至2022 年在瑞金医院接受甲状腺手术和2020 年至2022 年期间接受甲状腺细针穿刺（fine needle aspiration, FNA）的患者，排除血清TSH 异常患者。 于入组患者术后组织中直径＞0.5 cm 的实性部分取材，并将样本于液氮中速冻保存； 入组患者的甲状腺结节FNA 样本则于获得样本后2 h 内进行核酸抽提；对罕见甲状腺肿瘤亚型如甲状腺髓样癌等补充了福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin-embedding，FFPE）样本。 术后组织病理学诊断根据第5 版WHO 甲状腺肿瘤分类[1]完成。 肿瘤分期根据美国癌症联合委员会（American Journal of Critical Care, AJCC） 第七版TNM 分类系统进行。 本研究获得瑞金医院伦理委员会批准，所有入组患者均知情同意。

二、核酸抽提

使用AllPrep DNA/RNA micro kit （QIAGEN）试剂盒对液氮冻存组织和FNA 样本进行DNA 和RNA 提取，使用GeneReadTMDNA FFPE kit（QIAGEN）和QIAGEN RNeasy®FFPE kit 分别对FFPE 样本进行DNA 和RNA 提取。 使用NanoDropTM2000 和QubitTM4.0（InvitrogenTM）评估核酸质量和浓度。

三、靶向测序和生信分析

甲结Panel 使用Integrated DNA Technologies（IDT） 公司的xGenTM定制杂交捕获探针组对目标基因区域实现靶向富集， 使用Illumina NextSeq CN500 高通量测序仪对甲结Panel 靶向富集的文库进行测序。

由Illumina bcl2fastq 软件生成FastQ 文件；使用GATK 和HISAT2 软件完成gDNA 和cDNA 序列与参考基因组的比对；Mutect2 和VarDict 软件用于变异读取；Arriba 和STAR-Fusion 软件用于检测融合变异；CNVkit 软件用于分析拷贝数变异；基因表达使用TMM 标准化方法。

四、变异解读

变异解读参照美国医学遗传学和基因组学学会 （American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）2017 年体细胞变异解读指南进行。按ACMG 体细胞变异解读指南， 体细胞变异分类中仅Ⅰ～Ⅱ类变异（强临床意义和潜在临床意义）纳入研究分析。

结果

一、甲状腺结节分子分型

本研究总计完成856 例甲状腺结节样本的分子分型，入组患者平均年龄为（43.09±13.70）岁，女性占比75.0%（n=642）。 其中有678 例液氮速冻组织、133 例FNA 样本和45 例FFPE 样本。79.0%（n=676）甲状腺结节检出至少1 个突变。 最常见的突变检出基因为BRAF（n=426）；其次是RET（n=68），包括38 例RET融合基因和30 例RET基因的点突变或插入缺失变异；还有TERT（n=35）、HRAS（n=24）、NRAS（n=23）、神经营养酪氨酸受体激酶(neurotrophin receptor kinase,NTRK3） 融合基因 （n=19）、DICER1（n=19）、真核翻译起始因子1A, X 染色体 （eukaryotic translation initiation factor 1A，Xchromosomal，EIF1AX）（n=11）、BRAF融合（n=10）、SPOP（n=10）、KRAS（n=8）、细胞周期检测点激酶2（checkpoint kinase 2,CHEK2）（n=7）、 胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白3（insulinlike growth factor 2 mRNA binding protein 3,IGF2BP3） 融合基因（n=7）、EZH1（n=6）、TP53（n=36）、TSHR（n=5）、ALK融合基因（n=4）、ATM（n=4）、NTRK1（n=3）、PIK3CA（n=3）等。

FNA 样本中有106 例存在TG基因表达，可判断为甲状腺滤泡细胞来源甲状腺结节， 其中44 例（41.5%）检出变异，变异基因分别为BRAF、NRAS、KRAS、HRAS、BRAF融合基因、RET融合基因、DICER1、EIF1AX、NTRK3融合基因、SPOP、TSHR等。

二、甲状腺结节分子分型与病理类型

627 例甲状腺结节病理类型结果明确。其中恶性结节中经典型乳头状癌最为常见，有285 例（45.5%）；其次是乳头状微癌96 例 （15.3%）； 髓样癌91 例（14.5%）；滤泡亚型乳头状癌32 例（5.1%）；高柱细胞亚型乳头状癌13 例 （2.1%）， 弥漫硬化亚型9 例（1.4%），滤泡癌4 例，占比0.6%。97 例（15.5%）病理诊断为良性；恶性潜能未定的滤泡性肿瘤1 例（0.2%）。

经典型乳头状癌与乳头状微癌以BRAF基因变异为主， 占比80.1%（305 例）， 融合基因占比12.9%（56/435），其中75.0%（42 例）为RET融合和NTRK融合基因。髓样癌以RET基因变异为主，占比72.5%（66 例）， 其次是HRAS和KRAS， 占比19.8%（18 例）， 另外， 在髓样癌中检出1 例BRAFT599dup 和2 例BRAFN486_P490del。 滤泡亚型乳头状癌最常见变异基因为BRAF，占比43.8%（14 例），远低于BRAF基因变异在经典型乳头状癌与乳头状微癌的检出。而在9 例弥漫硬化亚型中检出5 例BRAF变异，3 例RET融合变异。

三、突变恶性百分比

对其中503 例滤泡细胞来源的甲状腺结节的分子分型结果和病理结果进行分析，变异恶性百分比如表1，总数小于3 例的分子分型不作统计。 发现BRAF类变异（BRAFV600E、RET融合）整体恶性百分比为97.3%；RAS类（NRAS、HRAS、KRAS、DICER1、EIF1AX、IGF2BP3融合） 变异整体恶性百分比为18.9%；良性结节相关基因整体恶性百分比为0。

表1 甲结Panel 检出突变的恶性百分比[n（%）]

讨论

本研究对856 例甲状腺结节完成了分子分型。PTC 是最常见的甲状腺肿瘤病理类型，BRAFV600E 是最常见的基因变异。甲状腺髓样癌以RET基因变异和RAS基因变异为主。 在甲状腺髓样癌中还检出1 例BRAFT599dup 和2 例BRAFN486_P490del 突变。 2023 年有研究首次报道了BRAF是甲状腺髓样癌驱动基因[9]。 良性甲状腺结节59.8%检出变异， 相关基因包括SPOP、EZH1、TSHR。 因此，甲状腺良性、恶性结节具有特异的分子分型，并可被检出。

甲状腺结节的良恶性鉴别是甲状腺结节诊疗的关键。本研究发现BRAF类变异整体恶性百分比为97.3%，而RAS类变异整体恶性百分比为18.9%。可见RAS类变异在作为标志物进行良恶性鉴别时需慎重。 在鉴别甲状腺结节良恶性时，RAS变异如何作为分子标志物应用仍然存在争议。有研究认为检出RAS突变的甲状腺结节提示低风险甲状腺癌，建议手术[10]；RAS突变合并TERT 启动子突变或EIF1AX基因突变时，则与高恶性度的甲状腺癌有关[11]，而FNA 细胞学不确定的样本中最常见的分子改变也是RAS突变[12]。 因此，RAS类甲状腺结节的良恶性鉴别是甲状腺结节分子诊断的重点和难点，未来可能需要联合转录或表观遗传特征进行判定。

基因融合变异在甲状腺癌的发生和发展中起着重要作用， 已有涉及RET、NTRK融合基因靶向治疗药物获得泛癌或多癌批准[13-15]。 美国癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）研究发现15.3%的PTC 存在融合基因变异[16]。 本研究完成mRNA 检测的435 例PTC 中，12.9%的PTC 检出融合基因变异，其中75.0%为RET、NTRK融合基因，可指导晚期进展甲状腺癌患者的靶向治疗药物选择。

对甲状腺结节进行分子分型，能辅助甲状腺结节的良恶性鉴别，并指导晚期甲状腺癌患者靶向治疗药物的确定[17]。 甲结Panel 可有效进行甲状腺结节的分子分型。