复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦青贮品质调控研究

蒋永梅,关 皓,李海萍,汪 辉,陈有军,贾志锋,刘文辉,陈仕勇,梁 骥,周青平,

(1.青海大学畜牧兽医科学院,青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室,青海 西宁 810016; 2. 西南民族大学四川若尔盖高寒湿地生态系统国家野外科学观测研究站,四川 成都 610041; 3. 四川文理学院化学化工学院,四川 达州 635000; 4. 西南民族大学畜牧兽医学院,四川 成都 610041)

我国南方地区冬闲田面积约占耕地面积的50%～60%,部分区域高达80%～90%,有些地方甚至全部撂荒[1]。大面积的冬闲田成为真正的“闲置田”,为杂草滋生创造有利条件,导致土壤肥力下降[2]。2023年中央1号文件指出,构建多元化食物供给体系,树立大食物观,大力发展青贮饲料,加快推进秸秆养畜。秋季利用冬闲田进行草田轮作,可以在不影响水稻、玉米等粮食作物播种的前提下,多种一季饲草,保障家畜饲草料供给。

燕麦(AvenasativaL.)具有喜冷凉、耐贫瘠,营养价值丰富,中性洗涤纤维含量较低且适口性好的特点,是南方地区冬闲田种植的优势作物之一[3-4]。青贮可更好的保留饲草的新鲜程度,贮藏时间长且养分流失较少,是南方地区燕麦加工利用的主要方法[5]。然而,南方地区受强降雨和大风等不利天气的影响,燕麦易发生倒伏,使叶片的空间分布和冠层结构打乱,引起茎叶等光合器官相互遮蔽,影响通风透光,致使茎秆底部的叶片变黄并腐烂,滋生有害微生物[6-8],同时燕麦倒伏后因接触土壤,在收获时会不可避免的将腐败燕麦植株和底部土壤带入,不仅不易机械收割,还会导致燕麦青贮的品质受到负面影响,已成为制约南方地区冬闲田种植燕麦的瓶颈问题。

目前,青贮品质的调控研究主要集中在青贮方式[9]、贮藏时间[10]、添加剂[11-12]、留茬高度[9,13]等方面。研究表明,乳酸菌能够将可溶性碳水化合物转化为乳酸和乙酸,快速降低pH,抑制不良微生物繁殖,发挥保存青贮饲料营养品质以及防止青贮饲料变质作用[14];留茬高度增加可提高植物叶茎比,促进发酵过程中可溶性碳水化合物增加,同时带入泥土减少,降低土壤中肠杆菌等微生物竞争利用发酵底物,从而使乳酸菌产生更多的有机酸,进而改善发酵品质[15]。杨晶晶等[16]研究发现乳酸菌剂和留茬高度可改善倒伏全株玉米青贮品质、减少养分损失。那么,倒伏燕麦青贮品质的调控是否也与倒伏玉米一致,受乳酸菌和留茬高度的影响?然而查阅文献发现,关于对倒伏燕麦青贮品质调控鲜见报道,在实际生产过程中,倒伏燕麦依旧会被刈割收获制作青贮,但倒伏后适宜收获的留茬高度以及乳酸菌的添加是否能减少倒伏对燕麦青贮的不利影响还不得而知,基于此,本研究通过探讨复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦青贮品质、微生物组成及发酵品质的影响,明确倒伏燕麦青贮较优的调制手段,以期为尽可能减少倒伏对燕麦青贮造成的损失提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 采样区概况

采样地位于国家草品种试验基地(四川新津),103°45′E,30°29′N,平均海拔478 m,属亚热带湿润季风气候,年降雨量1 902 mm,最高气温39.1℃,最低气温17.6℃,平均相对湿度79%,平均风速1.4 m·s-1(数据来源:https://rp5.ru)。

1.2 试验材料

供试材料为燕麦(AvenasativaL.),品种为‘青海444’,于2021年10月播种,播种量为75 kg·hm-2,条播,行距为30 cm,小区面积为15.3 m2(3 m×5.1 m),底肥为60 kg·hm-2磷肥(含12% P2O5),分蘖期追施70 kg·hm-2尿素(含46%N)。

供试菌株为植物乳杆菌149(Lactobacillusplantarum,专利号:CN108060104B)和鼠李糖乳杆菌753(Lactobacillusrhamnosus,专利号:CN110591988B)按照1∶1混合。

1.3 青贮制作

采用双因素试验设计,添加乳酸菌处理有未接种乳酸菌(添加等量的无菌水)和接种乳酸菌(浓度为106cfu·mL-1左右,添加量为3%)2个水平,根据倒伏燕麦贴近地面植株长度(图1),留茬高度设置分别为0 cm(H1),15 cm(H2),30 cm(H3),45 cm(H4),试验共8个处理(表1),每个处理3次重复。

表1 试验处理编号Table 1 The number of treatments

图1 倒伏燕麦示意图Fig.1 The diagram of lodging oats

试验于2022年5月1日采用人工刈割方式对乳熟期倒伏燕麦(拔节期开始倒伏,倒伏持续时间为45天)进行刈割,留茬高度分别为0,15,30 和45 cm,将刈割后的倒伏燕麦立即用揉丝机切碎为1～2 cm,并进行混匀。称取400 g左右的样品(含水量为70.20%～79.06%)按照3%接种量喷洒复合乳酸菌剂(浓度为106cfu·mL-1左右),对照喷洒等量的无菌蒸馏水,混合均匀后装入聚乙烯塑料袋中(260 mm×350 mm)压实后抽真空,每个处理设为3个重复,置于室温环境中进行发酵。青贮60 d后开袋,将青贮样品混匀后,称取20 g与180 mL无菌蒸馏水混合均匀用于青贮微生物组成和发酵品质的测定。取300 g左右青贮样品置于烘箱中烘干至恒重,用粉碎机粉碎后用于营养品质测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1营养品质 将各处理青贮样品置于65℃烘箱中烘干至恒重测定干物质(Dry matter,DM)含量,并将烘干的样品用粉碎机粉碎,过1 mm筛用于营养品质的测定。可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate,WSC)用蒽酮-硫酸比色法测定,粗蛋白质(Crude protein,CP)利用凯氏定氮法测定,中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)用范氏(Van Soest)洗涤纤维法测定,粗灰分(Ash)采用马弗炉灼烧测定[17]。

1.4.2发酵品质 称取20 g青贮样品置于装有180 mL蒸馏水自封袋,经1 000 r·min-1,4℃下摇床上振荡30 min后用双层纱布过滤,采用pH计测定滤液的pH值,用高效液相色谱仪测定乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)及丁酸(Butyric acid,BA)含量[17]。

1.4.3微生物组成 原料和青贮样品中微生物组成采用平板计数法测定[17]。乳酸菌数量采用MRS培养基在37℃厌氧培养箱中培养48 h,酵母菌和霉菌数量采用马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)培养基在有氧培养箱中培养72 h,肠杆菌数量采用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA)在37℃有氧培养箱中培养24 h。选取30～300个菌落数的平板进行计数,并按以下公式计算:菌数(cfu·g-1)=同一稀释度的重复平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品克数。

1.5 数据分析与处理

试验数据用Excel 2019.0软件进行整理,采用SPSS 25.0软件进行独立样本T检验、双因素方差分析和主成分分析,并通过Duncan法进行多重比较。用Origin 21.0软件作图,分析青贮指标间的相关性。运用隶属函数法对青贮品质指标转化后进行主成分分析,其中与青贮品质呈正相关的指标用公式(1),与青贮品质呈负相关的指标用公式(2)。

Fi=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

Fi=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中:Fi表示各指标的隶属函数值,Xi表示该指标的测定值;Xmax表示该指标的最大值;Xmin表示该指标的最小值。

2 结果与分析

2.1 倒伏燕麦原料特性

由表2可见,倒伏燕麦原料干物质含量为18.50%～22.43%FW,WSC含量为0.97%～1.55%DM,其中留茬高度为30 cm时,DM,WSC含量最低。CP含量为8.75%～10.27%DM,NDF和ADF含量分别为39.29%～51.09%DM,20.94%～29.80%DM,Ash含量为7.23%～8.54%DM,乳酸菌、霉菌、酵母菌和肠杆菌数量分别为2.01～2.60,4.15～4.41,3.62～3.81,4.33～5.13 lg·cfu·g-1FM。随着留茬高度的增加,CP含量显著增加(P<0.05),Ash含量、乳酸菌数量呈先下降后上升的趋势(P<0.05),NDF和ADF含量、霉菌数量呈先上升后下降的趋势,肠杆菌数量呈下降趋势(P<0.05),而对酵母菌数量没有显著影响。其中,留茬高度为45 cm时倒伏燕麦原料CP含量最高,NDF含量最低。

表2 倒伏燕麦原料化学成分及微生物Table 2 Chemical composition and microbial composition of lodging oat material before ensiling

2.2 复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦青贮营养品质及微生物组成的影响

由表3可见,相同留茬高度,接种复合乳酸菌增加DM,WSC,CP含量(留茬高度为30 cm除外),降低DM loss,NDF,ADF,乳酸菌数量,其中对留茬高度为0 cm和45 cm时DM loss、留茬高度为45 cm NDF和ADF含量,留茬高度为30 cm的WSC含量具有显著影响(P<0.05)。不同留茬高度,JH4处理DM含量显著低于其他留茬高度(P<0.05),H4和JH4处理NDF、ADF含量显著低于其他留茬高度(P<0.05),H4和JH4处理CP含量显著高于其他留茬高度(P<0.05),而在其余处理下不同留茬高度间无显著影响。所有处理倒伏燕麦青贮后均未检测到霉菌、酵母菌及肠杆菌。接种复合乳酸菌对倒伏燕麦青贮DM loss,CP,NDF,ADF和乳酸菌数量具有极显著影响(P<0.01),对DM和WSC含量有显著影响(P<0.05),不同留茬高度除对DM loss和WSC含量无显著影响外,而对其他指标具有极显著影响(P<0.01)。接种复合乳酸菌和不同留茬高度的交互作用对倒伏燕麦青贮CP,NDF,ADF,乳酸菌数量均有极显著影响(P<0.01),而对其他青贮指标没有影响。综上,接种复合乳酸菌,倒伏燕麦青贮乳酸菌数量下降,JH4处理青贮CP含量最高、NDF和ADF含量最低。

2.3 复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦青贮发酵品质的影响

由表4可见,相同留茬高度,接种复合乳酸菌显著降低倒伏燕麦青贮pH和AA含量(留茬高度为15 cm除外)、NH3-N/TN,PA含量(P<0.05),显著增加了LA含量(P<0.05)。所有倒伏燕麦青贮均未检测到BA含量。随着留茬高度的增加,倒伏燕麦青贮pH,LA,PA含量下降,AA含量上升,其中接种复合乳酸菌+留茬高度为45 cm处理青贮pH和PA含量显著低于其他处理。接种复合乳酸菌、不同留茬高度对青贮pH,NH3-N/TN,LA,AA,PA均有极显著影响(P<0.01),接种复合乳酸菌和不同留茬高度的交互作用对NH3-N/TN,LA,AA,PA均有极显著影响,对pH具有显著影响。

表4 复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦青贮发酵品质的影响Table 4 Effects of compound lactobacillus and cutting height on lodging oat silage fermentation quality

2.4 倒伏燕麦青贮指标间的相关性分析

由图2可知,DM含量与LA呈极显著正相关(P<0.01),与Ash呈极显著负相关(P<0.01),与DM loss、乳酸菌、NH3-N/TN呈显著负相关(P<0.05)。DM loss与发酵品质(除LA外)呈极显著正相关(P<0.01),与Ash呈显著正相关(P<0.05),与WSC呈显著负相关(P<0.05)。WSC含量与发酵品质(除LA和AA外)呈极显著负相关(P<0.01),与Ash呈显著负相关(P<0.05)。CP含量与PA呈极显著负相关(P<0.01),与pH显著负相关(P<0.05)。NDF与ADF,NH3-N/TN,AA呈极显著正相关(P<0.01),与pH呈显著负相关(P<0.05)。ADF与AA呈显著正相关(P<0.05)。Ash与pH、PA呈极显著正相关(P<0.01),与LAB呈显著正相关(P<0.05),与LA呈极显著负相关(P<0.01)。LAB与发酵品质(除LA和AA外)呈极显著正相关(P<0.01)。pH与发酵品质(除LA和AA外)呈极显著正相关(P<0.01)。NH3-N/TN与AA、PA呈极显著正相关(P<0.01),与LA呈极显著负相关(P<0.01)。LA与PA呈极显著负相关(P<0.01)。

图2 倒伏燕麦青贮指标间的相关性分析Fig.2 Correlation analysis on the indicators of lodging oat silage注:“*”表示相关性显著(P<0.05);“**”表示相关性极显著(P<0.01)Note:“*” mean a significant level of correlation (P<0.05);“**” an extremely significant level of correlation (P<0.01)

2.5 倒伏燕麦青贮品质综合评价

将青贮品质数据经隶属函数法转化后进行主成分分析(表5),第1主成分的方差贡献率为54.86%,第2主成分的方差贡献率为19.08%,第3主成分的方差贡献率为12.68%,前3个主成分的累积方差贡献率为86.62%,符合主成分分析的要求。因此,采用3个主成分分析可以代表倒伏燕麦青贮品质的变异信息。

表5 主成分的因子载荷量、特征值与贡献率Table 5 Loading factor,eigenvalue and contribution rate of principal components

表6 倒伏燕麦青贮品质综合得分与排序Table 6 Comprehensive score and ranking of silage quality of lodging oats

根据特征向量与标准化的数据相乘得到以下主成分的表达式:

Y1=0.206X1+0.320X2+0.311X3+0.246X4+0.236X5+0.177X6-0.220X7-0.316X8+0.360X9+0.333X10+0.294X11-0.193X12+0.314X13

Y2=-0.324X1+0.192X2+0.025X3-0.077X4+0.445X5+0.476X6+0.333X7+0.216X8-0.136X9+0.150X10-0.287X11-0.377X12-0.065X13

Y3=-438X1-0.271X2+0.008X3+0.507X4+0.221X5+0.230X6-0.139X7-0.031X8+0.041X9-0.241X10-0.085X11+0.448X12+0.297X13

由公式Y=0.549×Y1+0.191×Y2+0.127×Y3计算不同处理青贮品质的综合得分并排序(见表5),综合得分越高,品质越佳。由此可得出,接种复合乳酸菌+留茬高度为45 cm处理青贮品质最佳。

3 讨论

3.1 倒伏燕麦原料特性

青贮前饲料本身的营养品质及其微生物组成影响青贮发酵过程[18]。本研究发现,倒伏燕麦原料干物质含量为18.50%～22.43%FW,WSC含量为0.97%～1.55%DM。DM和WSC含量较低可能与燕麦倒伏后,正常的冠层结构被破坏,植物光合作用减弱,有氧呼吸受到抑制,导致植株腐烂,植物生长受阻以及倒伏阻碍了木质部和韧皮部水、营养物质的运输有关[19]。本研究结果显示,CP含量随留茬高度的增加呈上升趋势,究其原因可能是燕麦在拔节期倒伏,CP的积累源于抽穗前期叶片中积累的氮[20]。留茬高度低,采取样品的腐烂程度相对较高,植株体内营养成分也随之减少,留茬高度高,采取的植株体内营养成分会随腐烂程度的降低而增加,同时留茬高度高也会增加采取燕麦植株顶部的机率,燕麦植株顶部相比底部其纤维化程度较低,同时受丰富叶片和种子的影响,其粗蛋白质含量也相对较高。Ash含量随留茬高度的增加呈先下降后上升的趋势(P<0.05),其原因可能是留茬高度为0 cm采样时易带入土壤,留茬高度15 cm和30 cm植株倒伏腐烂程度高于留茬高度45 cm。DM含量随着留茬高度的增加呈先下降后上升的趋势,这与Kennington等[21]研究结果不一致,可能是原料中茎秆比重减少、叶片比重增加,且叶片中DM含量低于茎秆。而留茬高度为45 cm DM含量显著高于留茬高度30 cm,可能是因为刈割贴近土壤部分的植株较少。NDF和ADF含量随留茬高度的增加呈先上升后下降的趋势,这可能与燕麦倒伏后附着的土壤有关,土壤中含有能分解纤维素的微生物,随着留茬高度由0 cm增加为30 cm,分解纤维素的微生物减少,使NDF和ADF含量上升,留茬高度为45 cm时,贴近土壤的植株基本不会被刈割,叶片和籽实比重增加,茎秆比重降低,降低了NDF和ADF[15]。

牧草表面附着大量的与其长期共存微生物,受环境等因素的影响,其种类和数量存在很大差异,在青贮过程中微生物演替变化影响青贮发酵品质[18]。本研究发现,乳酸菌数量为2.01～2.60 lg cfu·g-1FM,远低于青贮成功的最低条件[18],霉菌、酵母菌和肠杆菌数量分别为4.15～4.41 lg cfu·g-1FM,3.62～3.81 lg cfu·g-1FM,4.33～5.13 lg cfu·g-1FM,相对来说较高,究其原因可能是燕麦倒伏后为有害微生物滋生提供有利条件。随着留茬高度的增加,乳酸菌数量呈先下降后上升的趋势,可能与燕麦倒伏后植株相互遮蔽为乳酸菌生长提供厌氧环境有关;霉菌数量呈先上升后下降的趋势,肠杆菌数量呈下降趋势,这可能与燕麦倒伏后植株附着的土壤有关[15]。

3.2 复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦青贮品质及微生物组成的影响

青贮营养品质是评价青贮饲料饲用价值的重要指标之一[10]。相同留茬高度,接种复合乳酸菌增加了DM、WSC和CP,降低了DM loss,NDF,ADF和乳酸菌数量,这可能是因为外源乳酸菌增加青贮DM含量,减少干物质损失,此外,接种的乳酸菌可能破坏了纤维结构,从而降低了青贮中纤维素含量。在本研究中,接种复合乳酸菌显著降低青贮中乳酸菌数量,可能是因为外源乳酸菌在青贮发酵初期起关键作用,青贮后期,较低的pH抑制了乳酸菌生长[22]。接种复合乳酸菌显著增加WSC、CP含量,这与王挺等[10]和李小玲等[12]研究结果不一致,说明在青贮过程中,添加的乳酸菌迅速降低了pH,从而抑制了不良微生物的生长,减少了对WSC的消耗和CP的分解,这一研究结果与肖燕子等[23]研究结果相似。本研究发现,所有处理青贮后均未检测到霉菌、酵母菌、肠杆菌,这可能是在青贮发酵过程中乳酸菌的大量增殖使其成为优势种,pH迅速降低,从而抑制了霉菌等的生长。随着留茬高度的增加,接种乳酸菌处理青贮DM,NDF,ADF,Ash含量下降,CP含量增加,乳酸菌数量减少,这与原料特性有关,另外受复合乳酸菌和不同留茬高度交互作用影响。JH4处理青贮DM,NDF,ADF含量显著低于其他处理,CP含量显著高于其他处理,说明该处理可以改善倒伏燕麦青贮营养品质。综上可见,留茬高度是改善倒伏燕麦青贮品质措施之一,留茬高度过低,倒伏燕麦腐烂严重,且易带入土壤,从而使有害微生物大量增殖,不利于青贮的发酵,而随着留茬高度的增加,倒伏燕麦品质得到改善[16]。

3.3 复合乳酸菌和留茬高度对倒伏燕麦发酵品质的影响

pH、氨态氮/全氮(NH3-N/TN)、有机酸含量是衡量青贮料发酵品质关键的指标[24]。本研究结果显示,相同留茬高度,接种复合乳酸菌显著降低倒伏燕麦青贮pH和AA含量(除留茬高度为15 cm)、NH3-N/TN、PA含量,显著增加LA含量,说明在发酵后期,添加外源乳酸菌使青贮中LA含量增加,pH降低,酸性环境抑制好氧细菌和乳酸菌生长,使青贮后乳酸菌数量减少,这印证了青贮指标间的相关性分析结果,吴安琪[25]也得到了相似的结论。另外,pH抑制植物蛋白酶以及微生物酶的活性,降低了青贮过程中蛋白的降解,也可能是同型发酵乳酸菌植物乳杆菌149通过减少乙酸发酵,增加干物质损失来降低青贮中NH3-N/TN含量,这与Ellis等[11]研究结果一致。本研究中,所有处理燕麦青贮均未检测到BA含量,究其原因可能是青贮中乳酸菌的增殖,抑制了不良微生物的发酵,从而降低了BA的含量,这与张玉琳等[26]研究结果相似。

随着留茬高度的增加,倒伏燕麦青贮pH,LA,PA下降,AA含量上升,其中JH4处理青贮pH,PA含量显著低于其他处理,这可能是因为留茬高度越高,燕麦倒伏后与土壤接触的面积减少,促进青贮发酵,说明留茬高度可以改善倒伏燕麦青贮发酵品质。青贮NH3-N/TN含量随留茬高度的增加无显著变化,这与郝阳毅等[27]研究结果相一致,因此,留茬高度对倒伏燕麦青贮蛋白质降解没有影响。综上所述,倒伏燕麦青贮品质与留茬高度密切相关,且接种复合乳酸菌也会显著影响倒伏燕麦青贮品质。

3.4 倒伏燕麦青贮品质综合评价

采用隶属函数和主成分分析相结合的方法对倒伏燕麦青贮品质进行综合评价。但是,各指标间计量单位和数据量纲不同,利用隶属函数法对原始数据进行标准化,增强结果的准备性[28]。主成分分析通过降维将多个指标转化为包含80%以上信息的几个综合指标进行综合评价[29]。本研究发现,第1主成分的方差贡献率(54.86%)最大,主要反映的指标为pH,NH3-N/TN、干物质损失、PA、WSC,说明是倒伏燕麦青贮品质评价中最重要的影响因子,第2主成分主要反映的是NDF、ADF,第3主成分主要反映的是CP,AA。综合评价结果表明,JH4处理青贮品质最佳,其综合得分为1.11,这与JH4处理营养品质和发酵品质相对较好相互印证,说明隶属函数和主成分分析评价方法避免了单一指标评价倒伏燕麦青贮品质的片面性。

4 结论

燕麦倒伏后减少其刈割贴土壤部分植株,可降低腐坏植株及土壤卷入对燕麦青贮品质造成的负面影响。加入适宜的乳酸菌菌剂,可提高倒伏后的燕麦青贮中的发酵品质。通过隶属函数和主成分分析进行综合评价发现,成都地区采用“接种复合乳酸菌+留茬高度为45 cm”方式可改善倒伏燕麦青贮品质。