紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析

李家兴,周丽莹,苑 峰,刘亚玲,栾雅琳,晁跃辉*

(1.北京林业大学草业与草原学院,北京 100083; 2.北京理工大学生命学院,北京 100081;3.内蒙古草业技术创新中心有限公司,内蒙古 呼和浩特 010010)

HB1基因属于同源异性盒(Homeobox,HB)蛋白家族,它含有典型的HD-Zip转录因子结构,由同源异型域(Homeodomain,HD)与亮氨酸拉链(Leucine Zipper,LZ)结构域共同构成。它们之间形成的稳定空间结构及两者之间的相互作用共同决定了该类蛋白作为转录因子的功能,如DNA结合特异性、信号传导、生物和非生物胁迫的调控诱导等[1-2]。Sessa等[3]通过HD-Zip蛋白与DNA结合的方法,从拟南芥(Arabidopsisthaliana)中分离了第一个HD-Zip I亚族转录因子AtHB1,发现其主要参与植物叶片发育及植物对胁迫的应答。随后,HB1基因在向日葵(Helianthusannuus)[4]、棉花(Gossypiumspp)[5]、玉米(Zeamays)[6]、大麦(Hordeumvulgare)[7]、黄花苜蓿(Medicagofalcata)[8]等多种植物中相继被发现并开展了相关的研究。向日葵在低温的条件下诱导并积累HaHB1蛋白质,通过提高细胞膜稳定性来抵御低温胁迫[4]。在干旱、盐胁迫条件下,棉花通过提高GhHB1基因的表达,参与ABA生物合成,提高了植物ABA含量,进而增强了植物对干旱和高盐的抵抗能力[5]。HB1转录因子可以抑制转基因蒺藜苜蓿的发育,通过减少根系表面暴露进而提高植物耐盐性[9]。而紫花苜蓿研究发现,紫花苜蓿MsHB7基因能够通过降低ABA响应基因(MsABI1和MsSnRK2.6)和抗氧化酶编码基因(MspxdC和MsCatalase4)的表达,进而降低紫花苜蓿耐盐性[10]。

作为一种优质的豆科牧草植物,紫花苜蓿营养价值丰富,粗蛋白含量高,含有多种维生素和微量元素等,适合作为饲料喂养家畜,增加畜产品产量[11-12]。现在土地季节性干旱、土壤中盐碱含量过高等问题严重限制了紫花苜蓿的种植,影响了紫花苜蓿的产量和品质[13-14]。因此,深入探索并发掘抗逆响应基因、通过转基因技术获得高抗逆能力的紫花苜蓿新品系,已成为紫花苜蓿分子育种的一个重要途径。植物激素脱落酸是植物响应胁迫信号转导的主要成员,对植物生长发育的多个环节起到调节作用,如抑制生长和抵抗逆境等方面[15]。杨跃霞等[16]研究证明了外源ABA可以增强紫花苜蓿耐盐性。同时,李波等[17]研究发现在盐胁迫的条件下,通过外施ABA可以降低紫花苜蓿幼苗的ROS积累,提高抗氧化酶活性。魏天娇等[18]发现ABA积累能够诱导盐胁迫相关基因的表达,从而提高紫花苜蓿对盐碱胁迫的耐受性。王英哲等[19]研究发现,通过外施ABA可以提高紫花苜蓿幼苗体内的可溶性糖和游离脯氨酸的含量,提高紫花苜蓿的耐寒性。因此,通过喷施外源ABA在紫花苜蓿抗旱、抗盐和抗寒等生理过程中起着重要作用。

本文成功克隆紫花苜蓿MsHB1基因,进行了生物信息学分析,原核表达及基因表达特征分析。探讨紫花苜蓿MsHB1基因时空差异、激素诱导或盐胁迫下表达特征,为后续研究MsHB1基因的功能提供了依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料、试剂及仪器

本试验的紫花苜蓿品种为保定苜蓿,保存于北京林业大学草业与草原学院实验室;基质为草炭、蛭石、珍珠岩,体积比为3∶3∶1,光周期为14 h/10 h(日/夜),温度为24℃,湿度为64%。大肠杆菌BL21、DH5α感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司;克隆载体pMD19-T、原核表达载体pCold-Sumo2、植物总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、PrimeSTAR MAX及限制性内切酶购于TaKaRa公司;DL5000 DNA Marker购于湖南艾科瑞生物工程有限公司;彩色预染蛋白Marker(10～170 kD)购于上海碧云天生物技术有限公司。抗体Anti-strep tag Ⅱ mouse monoclonal antibody和HRP-conjugated goat Anti-mouse IgG购于生工生物工程(上海)股份有限公司;植物激素ABA、6-BA、GA3和IAA购于Sigma公司。水平电泳仪(Wide Mini-Sub Cell GT Cell)、凝胶电泳成像系统(ChemiDocTMXRS+System)和超灵敏化学发光成像仪(ChemiDocTMImaging System)均购于Bio-Rad公司。

1.2 试验方法

1.2.1MsHB1基因克隆 收集成熟期紫花苜蓿叶片,置于研钵中,加入液氮充分研磨,使用植物总RNA提取试剂盒提取紫花苜蓿总RNA,利用反转录试剂盒得到第一链cDNA。以紫花苜蓿cDNA为模板,MsHB1-F和MsHB1-R为引物,利用PrimeSTAR MAX进行PCR扩增目的基因,程序为98℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,30个循环;72℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,连接至克隆载体pMD19-T。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上,挑取单克隆菌落进行PCR鉴定,将含有正确条带的单克隆菌落送至北京睿博兴科生物公司测序,对测序结果进行比对和分析,将测序正确的克隆载体命名为pMD-HB1。

1.2.2引物设计 基于公布的紫花苜蓿基因组数据[20],通过软件Primer Premier 5.0进行引物设计(表1)。其中,MsHB1-F和MsHB1-R用于MsHB1基因克隆,pCold-HB1-F和pCold-HB1-R用于原核表达载体构建,MsHB1-RT-F和MsHB1-RT-R用于MsHB1基因荧光定量检测,MsActin-F和MsActin-R用于内参基因Actin荧光定量检测。

1.2.3MsHB1生物信息学分析 通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对MsHB1蛋白保守结构域进行分析预测,通过SOPMA(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)和Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)分别对MsHB1蛋白进行二级、三级结构的预测,根据ExPASy数据库(http://expasy.org/)进行蛋白理化性质分析。采用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)进行蛋白质信号肽的预测,利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。通过TMHMM-2.0网址(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)进行蛋白质跨膜结构预测,在Cell-PLoc网站上(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)进行亚细胞定位预测。

1.2.4MsHB1原核表达载体构建 使用质粒小提试剂盒提取pMD-HB1质粒,以质粒为模板,pCold-HB1-F和pCold-HB1-R为引物,进行PCR扩增,程序为98℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,30个循环;72℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,对PCR产物进行纯化回收,将纯化后的PCR产物连接至限制性内切酶NcoI处理后的原核表达载体pCold-Sumo2。连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,涂在含有氨苄青霉抗性的LB固体培养基上。挑取单菌落进行PCR鉴定,将含有正确条带的单克隆菌落送至生物公司测序,将测序正确的质粒命名为pCold-HB1。

1.2.5MsHB1蛋白原核表达 挑取含有pCold-HB1单克隆菌落,摇菌培养至OD600= 0.6,分别加入终浓度为0.1,0.2,0.5 mmol·L-1的IPTG,14℃低温诱导14 h。将大肠杆菌样品,使用离心机5 000 r·min-1离心10 min,弃掉上清,加入5 mL的1×PBS(pH=7.4)充分重悬菌液。吸取100 μL重悬菌液,混入20 μL的8 mol·L-1尿素溶液,99℃加热10 min后,将蛋白样品经SDS-PAGE电泳后,使用考马斯亮蓝染色。为分离可溶性蛋白和非可溶性蛋白,利用细胞破碎仪,设置功率60%,破碎15 min,使用离心机12 000 rpm分离出上清和沉淀。将收集的上清与沉淀样品,经SDS-PAGE电泳后,使用考马斯亮蓝染色,分析蛋白质的表达情况。对SDS-PAGE电泳后的样品,进行转膜,以Anti-strep tag Ⅱ mouse monoclonal antibody单克隆抗体为一抗,HRP-conjugated goat Anti-mouse IgG为二抗,进行WB分析,使用超灵敏化学发光检测仪进行拍照观察。

1.2.6MsHB1表达分析 为分析不同组织及发育阶段的MsHB1基因表达水平,选取长势一致的紫花苜蓿植株,选取根、茎、叶三个组织部位,成熟和衰老叶片;100 mmol·L-1的NaCl溶液处理紫花苜蓿样品,用于分析MsHB1基因盐胁迫响应;为了分析不同激素对MsHB1表达的影响,对紫花苜蓿植株分别喷施50 μmol·L-1ABA、10 μmol·L-16-BA、50 μmol·L-1GA3、10 μmol·L-1IAA,并在0,0.5,1,2,4,6,8,12,24 h这9个不同的时间点进行取样。将收集的样品液氮速冻处理后放至-80℃冰箱储存。使用植物总RNA提取试剂盒对样品进行总RNA提取,并反转录为第一链cDNA。以MsHB1-RT-F和MsHB1-RT-R为引物,MsActin为内参基因,进行荧光定量PCR检测。所有样品均设置3个生物学重复,根据2-△△Ct法[21]使用EXCEL 2010进行数据初步处理并作图,使用SPSS (26.0)软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 MsHB1基因克隆

以紫花苜蓿cDNA为模板,MsHB1-F和MsHB1-R为引物进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,在750～1 000 bp位置存在一条单一、清晰DNA条带(图1)。将上述产物,送至生物公司测序,测序结果显示:该DNA含有完整的紫花苜蓿MsHB1基因编码区。将该DNA序列转化为氨基酸序列后显示:紫花苜蓿MsHB1与蒺藜苜蓿MtHB1蛋白质的氨基酸序列有高达99%的相似,仅有一个氨基酸的差异(图2)。

图1 紫花苜蓿MsHB1基因的克隆Fig.1 Cloning of MsHB1 gene from alfalfa注:M,MB5000 DNA Marker;1,MsHB1基因Note:M,MB5000 DNA Marker;1,MsHB1 gene

图2 蒺藜苜蓿与紫花苜蓿HB1的氨基酸序列对比Fig.2 Comparison of amino acid sequences of HB1 between Medicago truncatla and alfalfa

2.2 生物信息学分析

MsHB1基因编码区为864 bp,共编码288个氨基酸(图3A),MsHB1蛋白的分子式为C1442H2244N398O471S12,分子量为47.654 KDa,理论等电点为4.77。根据保守域结构分析可知HB1属于HD-ZIP家族,在65位到120位氨基酸之间含有Homebox的保守结构域(图3B)。MsHB1蛋白质二级结构分析显示:其蛋白含有39.93%的α-螺旋和4.86%的β-转角(图3C);蛋白质的三级结构分析显示:其蛋白质主要由自由螺旋和环构成(图3D)。蛋白质信号肽预测显示,MsHB1蛋白无信号肽,亚细胞定位预测显示,MsHB1定位于细胞核。MsHB1蛋白不稳定指数为69.35,推测其为不稳定蛋白,平均亲水指数为-0.755,推测其为亲水性蛋白。利用MEGA7.0 软件系统绘制不同植物的HB1蛋白系统发育进化树,结果显示紫花苜蓿HB1蛋白与蒺藜苜蓿同源蛋白亲缘关系最近(图4),其次是红三叶(Trifoliumpratense)。

图3 紫花苜蓿MsHB1序列及结构分析Fig.3 Sequence and structure analysis of MsHB1 from alfalfa注:(A)MsHB1基因DNA序列和氨基酸序列;(B)MsHB1蛋白保守结构域预测;(C)MsHB1蛋白二级结构预测;(D)MsHB1蛋白三级结构预测Note:(A) DNA and protein sequences of MsHB1 gene;(B) Prediction of conservation domain of MsHB1;(C) Secondary structure prediction of MsHB1 protein;(D) Tertiary structure prediction of MsHB1 protein

图4 MsHB1蛋白进化树分析Fig.4 Evolutionary tree analysis of MsHB1 proteins

2.3 MsHB1

将含有pCold-HB1质粒的大肠杆菌BL21,涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上。挑取固体培养基上生长大小一致的单克隆菌落,引物为pCold-2f和pCold-r进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测所选大肠杆菌均能扩增出目标大小的DNA条带(图5)。经生物公司测序显示:该载体含有正确序列的MsHB1基因,无碱基突变、无移码突变,表明MsHB1原核表达载体构建成功,可以用于后续的试验。

图5 pCold-HB1鉴定Fig.5 Identification of pCold-HB1注:M,MB5000 DNA Marker;1～3,pCold-HB1质粒Note:M,MB5000 DNA Marker;1～3,pCold-HB1 plasmid

经诱导后,提取大肠杆菌表达产物,经SDS-PAGE电泳后,进行考马斯亮蓝染色,发现使用三种不同浓度的IPTG诱导后,大肠杆菌能够表达一个约45KDa的蛋白,而未经诱导的大肠杆菌不能表达该蛋白(图6)。该结果初步显示了紫花苜蓿MsHB1表达成功。

图6 MsHB1蛋白诱导前后的SDS-PAGE检测Fig.6 SDS-PAGE detection of MsHB1 protein before and after induction注:M,彩色预染Marker(10～170kD);1,未诱导蛋白;2,0.1 mmol·L-1 IPTG诱导蛋白;3,0.2 mmol·L-1 IPTG诱导蛋白;4,0.5 mmol·L-1 IPTG诱导蛋白;方框,目标蛋白Note:M,colour pre-stained Marker (10～170kD);1,uninduced protein;2,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced protein;3,0.2 mmol·L-1 IPTG-induced protein;4,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced protein;Box,target protein

为分析表达的蛋白质的可溶性,分别将诱导后的菌液样品利用细胞破碎仪进行破碎,分离上清和沉淀。经SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,发现三种不同浓度的IPTG诱导的大肠杆菌中均存在淀有明显的条带对比,其沉淀中含有存在的目标蛋白大约在45 KDa左右,0.1 mmol·L-1IT-PG与0.2 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1浓度相比,其对MsHB1的诱导能力更强(图7,8)。

图7 MsHB1蛋白诱导后沉淀SDS-PAGE检测Fig.7 SDS-PAGE detection of precipitation for MsHB1 protein after induction注:M,彩色预染Marker(10～170kD);1,0.5 mmol·L-1 IPTG诱导沉淀蛋白;2,0.2 mmol·L-1 IPTG诱导沉淀蛋白;3,0.1 mmol·L-1 IPTG诱导沉淀蛋白;4,未诱导沉淀蛋白;方框,目标蛋白Note:M,colour pre-stained Marker (10～170kD);1,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;2,0.2 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;3,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced precipitated protein;4,uninduced precipitated protein;Box,target protein

图8 MsHB1蛋白诱导后上清SDS-PAGE检测Fig.8 SDS-PAGE of supernatant after induction of MsHB1 protein图8:M,彩色预染Marker(10～170kD);1,未诱导上清蛋白;2,0.1 mmol·L-1 IPTG诱导上清蛋白;3,0.2 mmol·L-1 IPTG诱导上清蛋白;4,0.5 mmol·L-1 IPTG诱导上清蛋白;方框,目标蛋白Fig.8:M,colour pre-stained Marker (10-170kD);1,uninduced supernatant protein;2,0.1 mmol·L-1 IPTG-induced supernatant protein;3,0.2 mmol·L-1IPTG-induced supernatant protein;4,0.5 mmol·L-1 IPTG-induced supernatant protein;Box,target protein

选IPTG表达量含量高的0.1 mmol·L-1IPTG沉淀诱导蛋白进行Western Blot杂交检测,0.1 mmol·L-1浓度下诱导的蛋白有条带显示(图9),与SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果大小一致,0.1 mmol·L-1IPTG浓度下原核蛋白成功表达。

图9 MsHB1蛋白原核表达的Western Blot检测Fig.9 Western Blot detection of prokaryotic expression of MsHB1 protein注:1～2,0.1 mmol·L-1 IPTG诱导沉淀蛋白样品;3,未诱导蛋白对照Note:1～2,0.1 mmol·L-1 IPTG induced precipitated protein samples;3,uninduced protein control

2.4 MsHB1不同组织及发育时期表达分析

为分析MsHB1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中的表达差异,对MsHB1进行荧光定量RT-PCR检测,MsHB1基因在根、茎、叶中均有表达,而MsHB1基因在叶中表达水平略高,茎中表达水平最低(图10)。

图10 MsHB1基因不同组织的表达分析Fig.10 Expression analysis of MsHB1 gene in different tissues注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同Notes:Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level.The same as below

收集不同发育时期紫花苜蓿叶片,进行MsHB1荧光定量RT-PCR检测,结果显示:MsHB1在不同的叶片发育时期也存在差异,其中幼嫩叶片中的表达量最高,成熟和衰老叶片中的表达量低(图11)。

图11 MsHB1基因叶片不同发育阶段的表达分析Fig.11 Expression analysis of MsHB1 gene in leaves at different developmental stages

2.5 MsHB1基因对盐胁迫及外施激素响应

对不同盐胁迫的样品,进行荧光定量RT-PCR分析,结果显示:经过NaCl处理后,与未处理相比,紫花苜蓿中HB1基因的表达水平提升,其中,在6 h达到高峰,随后逐渐下降,但经24 h处理后,表达水平依为对照水平的1.85倍。因此,MsHB1基因参与NaCl胁迫应答(图12)。

图12 紫花苜蓿MsHB1基因的盐胁迫表达Fig.12 Expression of the MsHB1 gene in alfalfa under salt stress

对植物喷施不同激素,分别在不同时间点采样,进行荧光定量RT-PCR分析,外源ABA使MsHB1基因的表达水平呈先上升趋势,在6 h达到顶峰,之后基因表达量缓慢下降,与对照相比,MsHB1仍呈现较高水平,经ABA处理24 h基因表达水平为对照的2.11倍(图13A);外施GA3后4 h内,MsHB1基因表达变化并不显著,但在6 h后开始呈现上升的趋势,在12 h时短暂下降,与对照样品相比仍具有一定的上升趋势,在24 h后到达顶峰,是对照样品的8倍(图13 B);外源6-BA使MsHB1基因呈现先上升后下降的趋势,但MsHB1表达水平变化并不太大,在4 h达到顶峰,仅为对照样品的1.38倍,但在24 h表达水平最低,为对照样品的0.34倍(图13C);外源施加IAA使MsHB1短时间内快速下降,随后缓慢上升(图13D)。

3 讨论

植物在生长发育过程中可能会受到各种不利环境因素的影响,如干旱、低温、高盐等非生物因子胁迫。植物抗逆过程如其他生理过程一样,当植物受到逆境胁迫时,植物能够采取相应的策略来应对胁迫,在长期适应环境中也演化出了相应的一套复杂的防御网络机制[22-23]。脱落酸在整合各种胁迫信号和调控下游胁迫反应方面发挥重要作用,在生物和非生物胁迫过程中扮演着关键角色[24]。Lechner等[25]研究发现拟南芥中I类HD-Zip转录因子ATHB6是ABA反应的负调控因子,能够通过与MATH-BTB蛋白直接结合,进而引发蛋白泛素化过程。此外,Valde′s等[26]发现拟南芥中另外两个HD-Zip转录因子基因ATHB7和ATHB12的转录调控依赖于2C型蛋白磷酸酶(PP2C)的活性,而PP2CS在ABA信号传导过程中起着重要的调控作用,同时,AtHB7和AtHB12蛋白的结合可以抑制编码ABA受体基因的转录。为深入发掘HB1基因的功能及ABA调控HB1转录因子网络机制提供基础,本试验成功构建MsHB1- pCold-Sumo2载体,其与pET载体骨架相似,并转入大肠杆菌BL21中诱导表达,通过Western Blot验证MsHB1蛋白表达成功,约为45 KDa左右。本研究与紫花苜蓿MsIPT和MsDREB1原核表达结果一致[27-28],为后续蛋白纯化以及纳米抗体的制作提供了抗原。

HD-ZIP的I类转录因子能够参与逆境为胁迫或响应激素诱导,尤其响应ABA信号,该家族的基因随着ABA含量的变化而表达水平会发生变化[29-30]。通过生物信息学对MsHB1蛋白进行分析,构建系统发育树可知,紫花苜蓿MsHB1蛋白与蒺藜苜蓿同源蛋白亲缘关系最近,其次是红三叶。通过MsHB1表达分析可知,MsHB1在根茎叶中均有表达,推测MsHB1基因在根、茎、叶中均能发挥作用,且参与了植物的生长发育。蒺藜苜蓿HDZip-I亚族转录因子HB1在主根和侧根分生组织中表达,通过参与根部分生组织中ABA和辅酶信号的复杂相互作用,进而调控侧根的生长[9],拟南芥AthHB1主要调控叶片的生长与发育[31],番茄LeHB1则参与调控花发育及果实成熟调控[32]。因此,进一步说明在不同物种中的HB1的表达部位以及功能可能存在一定的差异性。在盐胁迫和ABA的处理下,MsHB1表达量明显提高,推测MsHB1可能参与盐胁迫和ABA信号传导进程。这与HB1基因在棉花[5]、水稻[29]的表达模式下十分相似。此外,MsHB1可能参与其他激素途径,如外源GA3,6-BA,IAA均能引起紫花苜蓿的MsHB1基因表达改变。本研究为此后关于MsHB1基因表达功能的研究提供了依据,关于MsHB1深入的生物功能以及调控机制,需进一步探索。

4 结论

本研究克隆了紫花苜蓿MsHB1基因,MsHB1的开放阅读框867 bp,编码了288个氨基酸,利用原核体系成功表达出MsHB1蛋白;MsHB1基因在紫花苜蓿根茎叶中均有表达,但茎的基因表达量低于根和叶的表达量;MsHB1参与ABA和NaCl的应答过程,GA3的能够提高MsHB1表达水平,而6-BA、IAA则会降低MsHB1表达,表明紫花苜蓿MsHB1基因参与多种激素信号传导途径。