五味化痔胶囊对痔模型大鼠炎症因子和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响*

河北中医药大学

韩世诚 王智森△ 高 飞△ 王 茜△△ 关胜江△△△ 赵胜男 陆艾阳子△△△△ 石 铖 陈 健 张一昕 柴天川△△△(石家庄 050091)

提要 目的：研究五味化痔胶囊对痔模型大鼠肛周肿胀、溃疡、出血等症状，直肠组织病理形态学，炎症因子，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB(PI3K/AKT/NF-κB)信号通路表达的影响，探究其治疗痔病的作用机制。方法：SD大鼠分为空白组、模型组、美沙拉嗪组、五味化痔胶囊低、中、高剂量组。选用角叉菜胶、脂多糖、山莨菪碱、酚磺乙胺混合液，注射于大鼠肛肠局部复制大鼠痔模型。造模后，中药各组予五味化痔胶囊干预7 d，观察肛周肿胀、溃疡、出血等症状表现，HE染色观察直肠组织病理形态，酶联免疫吸附试验检测组织匀浆中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)以及白介素-6(IL-6)的水平，qRT-PCR技术观察直肠组织中PI3K、AKT、NF-κB的基因表达，免疫组化法观察直肠组织环氧化酶2(COX2)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达。结果：与空白组相比，模型组肛周肿胀、溃疡、出血等症状评分升高(P<0.05)，光镜下观察到直肠组织黏膜缺损、间质血管扩张充血、炎性细胞浸润等情况；血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平上升(P<0.05)，直肠组织中PI3K、AKT、NF-κB的mRNA表达及COX2、iNOS蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组相比，美沙拉嗪组和五味化痔胶囊高、中剂量组症状评分下降(P<0.05)，直肠组织黏膜缺损、间质血管扩张充血、炎性细胞浸润等情况有所缓解；美沙拉嗪组和五味化痔胶囊高、中、低剂量组IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降(P<0.05)，PI3K、NF-κB mRNA表达和COX2、iNOS蛋白表达下降(P<0.05)，五味化痔胶囊高剂量组AKT mRNA表达下降(P<0.05)。结论：五味化痔胶囊可能通过抑制PI3K/AKT/NF-κB通路、调节炎症因子的水平治疗痔病。

痔病是一种常见的肛肠疾病，其主要症状包括肛门疼痛、肛门瘙痒、便血等。研究表明[1]，我国居民肛肠疾病发病率约为51.14%，其中以痔的发病率最高，为50.28%。虽然外科手术治疗是治疗痔病最直接的方法，可以快速消除痔组织，但患者的接受度较差，常选择保守治疗[2]。中医采用内服、熏洗坐浴、外敷等方法在痔的保守治疗方面具有显著的优势。

五味化痔胶囊是在中医理论指导下，总结多年临床实践经验，结合现代药理研究，精选药物，合理组方研制而成，主要由酒大黄、炒地龙、煅石决明、珍珠和人工牛黄组成，治疗痔疮湿热壅滞证可起到标本兼治之效。方中大黄性味苦寒，既能泻下攻积、清利湿热，祛除体内湿热邪气以治其本，又能凉血止血、化瘀解毒，缓解便血、肛门肿痛，口干口苦等症，以治其标，故为君药；人工牛黄清热解毒，地龙通经活血，辅助大黄化瘀解毒，共为臣药[3]；石决明、珍珠能够解毒生肌，促进肠黏膜恢复[4]，五药相合，共奏清泄湿热、解毒行瘀、凉血祛风之功。前期研究证明，五味化痔胶囊治疗痔病有较好的止血、消肿、止痛之功[5]。现代研究发现[6]，痔的发病与炎症反应密切相关，为了进一步探究五味化痔胶囊治疗痔病的作用机制，本文通过建立大鼠痔模型，观察大鼠肛周肿胀、溃疡、水肿、充血等情况，直肠组织病理形态学变化，炎症因子及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB(PI3K/AKT/NF-κB)通路相关基因、蛋白的表达，以期为指导临床应用提供更翔实的数据支撑。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g，生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。均由辽宁长生生物技术有限公司提供。实验动物饲养于恒温恒湿实验室内，自由进食饮水。该实验经河北中医药大学伦理委员会批准同意，编号YXLL2021045。

1.2 实验药物 五味化痔胶囊(酒大黄、地龙、石决明、珍珠、人工牛黄)、美沙拉嗪(葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，批号：H19980148)，分别用0.5%羧甲基纤维素钠配置到实验所需浓度；角叉菜胶干粉(上海易恩化学技术有限公司，批号：RH328493)和脂多糖(Solarbio公司，货号L8880)分别用生理盐水配成1%的角叉菜胶溶液和0.5%的脂多糖溶液；酚磺乙胺(新乡市常乐制药有限责任公司，批号：H4102151)和盐酸消旋山莨菪碱注射液(安徽长江药业有限公司，批号：H34021816)，以原剂型按照说明书剂量使用。

1.3 实验试剂 羧甲基纤维素钠[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号：C299502]，SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System试剂盒批号(Igenebio公司，批号：QP057)、BlazeTaqTMSYBR©Green qPCR mix 2.0试剂盒批号(Igenebio公司，批号：QP042)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，批号分别为：L221130959、L221228223、L230106753)，环氧化酶2(COX2)抗体(Boster公司，批号：BA0738)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体(Santa公司，批号：sc-7271)。

1.4 主要实验仪器 RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)，H17502型冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，GL1241-1SCN型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，BX43F型显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]，iChem-530型全自动生化分析仪(深圳市库贝尔生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 模型复制 按照参考文献[7]，采用多药物联合应用方法复制痔病模型：于大鼠肛门以内0.2 cm，4点位黏膜下浆肌层处，注射角叉菜胶溶液100 μL+脂多糖溶液10 μL+山莨菪碱注射液20 μL+酚磺乙胺注射液30 μL，每日1次，连续7 d。

2.2 分组及给药 实验动物适应性喂养7 d，随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪组(0.4 g/kg)、五味化痔胶囊低剂量组(0.15 g/kg)、中剂量组(0.3 g/kg)、高剂量组(0.6 g/kg)，每组10只，各组动物剂量根据人与动物体表系数折算。其中空白组、模型组灌胃给予生理盐水，美沙拉嗪组及五味化痔胶囊高、中、低剂量组给予相应药液，每次用药体积为1 mL/100 g，1次/d，连续7 d。

2.3 标本采集 末次给药后，禁食不禁水12 h，腹主动脉取血，离心15 min(4 000 r/min)，分离血清，待检炎性因子指标；随后立即剖腹，切取肛管至直肠段2 cm范围组织，纵向一分为二，一份置于4%多聚甲醛中进行固定，另一份置于冻存管中液氮冻存，以备检测相关基因、蛋白的表达。

2.4 一般情况观察 实验期间，记录各组大鼠的宏观体征变化，每日定时称重，记录饮食、排便等情况；测量大鼠肛周直径(用游标卡尺精确测量3次，取平均值)评价其肿胀程度，观察大鼠肛周炎性渗出及溃疡、红肿情况，并按照表1进行评分。

表1 痔模型大鼠肛周症状评分标准

2.5 HE染色法观察直肠组织病理形态学变化取4%多聚甲醛溶液固定的组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察直肠组织病理形态学变化。

2.6 ELISA法检测大鼠直肠组织中炎症指标水平 根据ELISA试剂盒说明书进行操作，检测大鼠直肠组织匀浆中TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平。

2.7 PI3K、AKT、NF-κB mRNA的表达 取直肠组织约150 mg，加入裂解液，提取总RNA，按照25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min的程序反转录为cDNA后，加入扩增反应体系，进行检测。PCR反应条件为20 μL体系，95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，40个循环。按照相对定量方法分析，以GAPDH作为内参，结果通过2-ΔΔct方法计算。引物序列见表2。

表2 引物序列表

2.8 免疫组织化学染色观察COX2及iNOS蛋白表达 根据检测试剂盒说明书操作，将常规石蜡包埋的组织切片放入60℃温箱烘l h；二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；孵育30 min，使用PBS冲洗3次；抗原修复后，加入一抗，孵育后滴加二抗；经DAB染色、脱水、透明后干燥封片，显微镜下观察COX2及iNOS蛋白表达，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像分析与处理。

2.9 统计方法 采用IBM SPSS25.0软件进行数据分析，正态性检验，符合正态分布采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较采用SNK-q法。不符合正态性或方差不齐，则采用Kruskal-WallisH秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况的比较 空白组大鼠精神状态良好，饮食、排便情况正常。与空白组相比，模型组大鼠出现精神萎靡，活泼程度减小，出现肛周肿胀、溃疡等症状，症状评分显著升高(P<0.05)，肛周直径有升高趋势(P>0.05)，提示痔病模型成功复制。经美沙拉嗪以及五味化痔胶囊中、高剂量给药治疗后，大鼠活泼程度有不同程度的改善，溃疡及肿胀程度有所降低，症状评分降低(P<0.05)，肛周直径有下降趋势(P>0.05)，提示美沙拉嗪和五味化痔胶囊均有较好的治疗作用，但两者比较差异无统计学意义。详见表3。

表3 各组大鼠肛周直径和症状评分变化

3.2 各组大鼠直肠病理组织形态 空白组黏膜上皮形态结构基本正常，腺体排列较为整齐。在模型组中，直肠黏膜缺损、结缔组织增生、腺体排列紊乱，间质可见血管扩张充血，伴炎症细胞浸润。美沙拉嗪组直肠黏膜上皮增生，腺体排列稍有紊乱，间质偶发血管扩张充血，偶见炎症细胞浸润。五味化痔胶囊低、中剂量组，腺体排列紊乱，间质可见血管扩张充血，偶见炎症细胞浸润。高剂量组直肠黏膜上皮增生，腺体排列稍有紊乱，间质偶发血管扩张充血，偶见炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠直肠组织病理学改变(100×)

3.3 各组大鼠直肠组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平 与空白组比较，模型组大鼠直肠组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05)；与模型组相比，美沙拉嗪组与五味化痔胶囊低、中、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠直肠组织匀浆中IL-6、IL-1β及TNF-α水平比较

3.4 各组大鼠直肠组织PI3K、AKT、NF-κB mRNA的表达 与空白组相比，模型组直肠组织PI3K、AKT、NF-κB mRNA表达均升高(P<0.05)；与模型组相比，美沙拉嗪组、五味化痔低、中、高剂量组PI3K、NF-κB mRNA表达降低(P<0.05，P<0.05)，美沙拉嗪组和五味化痔高剂量组AKT mRNA表达下降(P<0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠直肠组织中PI3K、AKT、NF-κB mRNA的表达

3.5 各组大鼠直肠组织COX2及iNOS蛋白表达与空白组比较，模型组大鼠COX2、iNOS表达明显升高(P<0.05)，与模型组比较，美沙拉嗪组与五味化痔胶囊低、中、高剂量组COX2、iNOS表达下降(P<0.05)。详见表6。

表6 各组大鼠直肠COX2、iNOS平均光密度的比较

4 讨论

中医学对痔的病因病机及治则、治法的阐述古已有之，《山海经·西山经》是最早记载痔的古籍[8]。《素问·生气通天论》言：“因而饱食，筋脉横解，肠澼为痔。”指出了食气滞留，湿热之气癖积于阳明大肠而为痔[9]。《五十二病方》最早将痔分为：牡痔、牝痔、脉痔、血痔，提出“絜以小绳，剖以刀”的治疗方法[10]。《丹溪心法》云：“痔者，皆因脏腑本虚，外伤风湿，内蕴热毒，醉饮交接，多欲自戕，以致气血下堕，结聚肛门，宿滞不散，而冲突为痔也。”[11]《医宗金鉴》提出“痔疮形名亦多般，不外风湿燥热源”，讲述了痔疮的病因为风、湿、燥、热等[12-13]。课题组认为，痔发病多为外感六淫、饮食不节、肠澼或长期便秘努挣、久行久坐、久咳等，致使脏腑功能紊乱，湿热蕴结于魄门，日久发而为痔，临床通常表现为疼痛、肿胀、痔核脱出、便血等症状。湿热毒瘀为其基本病机，清泄湿热、解毒行瘀为其有效治法，故根据临床经验创制了五味化痔胶囊。为了进一步探究五味化痔胶囊的作用机制，本研究基于痔病肛管局部静脉曲张、瘀滞、局部炎症、微循环障碍等病理特征及药理学原理，选用了微循环阻滞剂、肠道平滑肌运动抑制剂及致炎、致肿胀试剂以合适剂量联合应用复制痔动物模型[7]。首先，通过确定肛周症状评分标准，观察直肠组织病理形态学变化，证明了五味化痔胶囊能明显改善痔模型大鼠肛周溃疡、肿胀等症状，缓解直肠组织上皮增生、间质血管扩张充血，炎症细胞浸润等病理改变，提示其治疗痔病确实具有较好的疗效。其次，根据痔的病理特征主要是由炎症细胞及其释放的炎症介质引起毛细血管扩张，导致血管通透性增加所致，本研究从炎症通路角度揭示其作用机制。研究发现，TNF-α、IL-1β以及IL-6在痔的炎症反应中发挥了重要作用。其中TNF-α参与炎症反应的所有阶段，并有促进炎症介质分泌的作用，加重痔导致的水肿并会引发炎性细胞浸润，其含量的降低有助于减轻炎症反应和促进愈合。IL-6是参与调剂免疫功能及细胞相互作用的细胞因子，是评价创面炎症程度以及愈合程度的重要指标[14]。IL-1β主要由单核巨噬细胞产生，具有促进炎症细胞分泌、活化的作用，可提高内皮细胞通透性，加重肠道炎症反应[15]。IL-1β参与了IL-6和TNF-α的调节，为典型的多功能细胞因子，几乎对所有组织的细胞防御和组织修复至关重要，与痔病发生引起的疼痛、炎症密切相关。痔出现后局部组织损伤，创面难以愈合，巨噬细胞升高并参与炎症反应，引起TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，而在炎症反应中TNF-α与IL-6都具有炎症联级放大反应，从而激活更多炎症介质的表达，加重炎症反应[16]。本实验结果表明，五味化痔胶囊可以显著降低大鼠肠道组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，减轻直肠组织中的炎症反应。美沙拉嗪是一种常见的氨基水杨酸制剂，广泛应用于各类炎症性肠病，其药理机制主要在肠道黏膜上发挥作用，通过抑制促炎因子的合成，以实现抗炎症效应。其能够导致黏膜完全愈合的发生率约为35%[17]。可抑制白介素、白三烯、前列腺素E2等多种炎症因子的产生而降低肠道炎症反应，可改善因炎症导致的肠道充血、水肿、出血、疼痛等症状，与痔病炎症反应症状相似，故将美沙拉嗪作为阳性药，评价五味化痔胶囊的抗炎效果[18-19]。结果显示，五味化痔胶囊各剂量组抗炎效果与美沙拉嗪相似，无统计学差异。

PI3K是胞内信号转导的脂类第二信使，与痔病所产生的炎症反应密切相关，作为PI3K的下游靶点，AKT直接参与信号传递[20]，当PI3K激活后，AKT作为下游因子被磷酸化，激活的AKT可以通过多种途径促进NF-κB的激活和核转位，进而影响炎症相关基因的表达[21-22]。同时，NF-κB还能调控下游COX2和iNOS的转录，促进炎症反应的发生。其中COX-2在炎症状态下表达显著增加，促使炎症细胞产生大量炎症介质，导致炎症部位出现红、肿、热、痛，从而加重痔病引起的溃疡[13，23]；iNOS是细胞内重要的功能酶，能够诱导NO的产生，促进痔组织炎症部位TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子的渗出，加剧炎症损伤及诱导疼痛反应[24-25]，二者在炎症期间可相互作用，iNOS可诱导COX-2的表达，COX-2亦可促进iNOS的表达[26-29]，从而加重痔组织的炎症表现。本实验结果表明，五味化痔胶囊能下调痔模型大鼠直肠组织PI3K、AKT和NF-κB mRNA表达水平，减轻相关炎症介质COX-2以及iNOS的表达，从而改善痔模型大鼠的炎症反应。

综上所述，五味化痔胶囊可有效缓解痔病相关症状，可能是通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路，降低炎性因子水平来发挥治疗作用的。本研究结果为推动五味化痔胶囊的临床应用提供了有益借鉴，但其具体作用靶点及物质基础还有待深入系统研究加以验证。