补肾温阳化瘀方对子宫内膜异位症大鼠PKC信号通路的影响*

河北中医药大学中西医结合学院/河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室

张英美 罗 琳 牛若冰 胡书婵 朱 晗 孙 莹 贺 明(石家庄 050200)

提要 目的：研究补肾温阳化瘀方治疗子宫内膜异位症(EMs)的作用，探讨其调控蛋白激酶C(PKC)信号通路的机制。方法：将50只SPF级8～10周龄雌性SD大鼠随机分为5组，分别为假手术组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组和西药组，每组10只。采用自体移植法复制EMs大鼠模型，造模成功后分别给予补肾温阳化瘀方低、高剂量及孕三烯酮灌胃，假手术和模型组灌胃蒸馏水，连续21 d。HE染色观察在位内膜及异位灶的病理形态改变；Western blot测定在位内膜及异位灶磷酸化蛋白激酶C的α亚型(p-PKCα)、蛋白激酶C的α亚型(PKCα)蛋白的表达水平。结果：模型组在位内膜和异位灶p-PKCα蛋白水平升高；给予补肾温阳化瘀方治疗后，p-PKCα的蛋白表达水平降低(P<0.05)，PKCα的蛋白表达水平无明显变化。结论：补肾温阳化瘀方通过抑制PKC信号通路来治疗EMs。

子宫内膜异位症(EMs)是指子宫内膜组织(腺体和间质)生长在子宫腔被覆内膜及子宫以外的部位，简称内异症。其发病率逐年上升，仅次于妇科炎症性疾病和子宫肌瘤[1]。在育龄女性中，内异症的总体患病率约10%[2]。补肾温阳化瘀方应用于临床多年，临床疗效显著[3]。蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶家族中的一员，通过调节细胞增殖、黏附、迁移、侵袭和凋亡[4-5]等病理生理过程发挥重要作用。本研究通过观察补肾温阳化瘀方对PKC信号通路的影响，探讨补肾温阳化瘀方治疗EMs的可能分子机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠50只，8～10周龄，体质量(220±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2021-0011。

1.2 实验药物 补肾温阳化瘀方(组成：炮附子6 g，肉桂、小茴香各10 g，党参、炒白术各15 g，川芎、制没药各10 g，川楝子15 g，川牛膝10 g，桑寄生、狗脊各30 g，吴茱萸9 g等)购于乐仁堂药房，制成精制混悬液；中药低剂量组生药浓度3.9 g/mL，中药高剂量组生药浓度7.8 g/mL。异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，20110401)；孕三烯酮胶囊(北京紫竹药业有限公司，3210301)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，684A)；硫酸庆大霉素注射液(石药集团欧意药业有限公司，068210502)。

1.3 主要试剂 蛋白激酶C的α亚型(PKCα)抗体(proteintech，21991-1-AP)；磷酸化蛋白激酶C的α亚型(p-PKCα)、抗体(abcam，ab23513)；GAPDH(proteintech，60004-1-IG)；HRP标记的山羊抗兔IgG(Abbkine，A21020)；HRP标记的山羊抗鼠IgG(Abbkine，A21010)；伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司，G1108)；苏木素染色液(北京索莱宝科技有限公司，G1080)。

1.4 主要仪器 小动物麻醉机(美国MIDMARK公司，型号：VMR)；病理图文分析系统(日本，型号：DP72CCD)；切片机(德国LEICA，型号：RM2245)；摊烘烤片一体机(维克科教仪器有限公司，型号：VCM-TK7218)；低温高速离心机(基因有限公司，型号：173R)；分光光度计(基因有限公司，型号：NANODROP 2000C)；垂直电泳槽(美国伯乐公司，型号：Mini PROTEAN©Tetra Cell)；电泳仪(美国伯乐公司，型号：PowerPacTMUniversal Power Supply)；半干式转膜仪(美国伯乐公司，型号：Trans-Blot SD Cell)；化学发光系统(易孛特生命科学有限公司，型号：Touch Imager)

2 方法

2.1 动物模型建立 大鼠适应性喂养1 w后，按随机数字表法分为5组，每组10只，分别为假手术组、模型组、中药低、高剂量组和西药组。采用自体移植法建立内异症大鼠模型[6]。戊酸雌二醇片灌胃3 d，期间阴道涂片观察大鼠处于统一动情周期后，予以异氟烷麻醉，取大鼠尿道口正上方约2 cm 处开腹，剪右侧子宫中段(约2 cm)，立刻放置于生理盐水中，剥离干净后纵形剖开子宫，将子宫内膜面紧贴在左侧腹壁上，然后缝合固定在腹腔内壁。假手术组只开腹不造模。为预防术后感染，造模后给予庆大霉素腹腔注射，连续3 d，术后第4 d开始给药治疗。补肾温阳化瘀方低、高剂量组分别给予相应剂量19.4 g/kg 、38.8 g/kg灌胃，1次/d；孕三烯酮组灌胃剂量同临床等效剂量，即0.25 mg/kg，2次/w；假手术组、模型组及孕三烯酮组非给药时间均给与同体积蒸馏水灌胃，连续21 d。

2.2 组织的收集与处理 采用异氟烷对大鼠进行麻醉后，观察腹壁异位灶形态，取异位灶和在位子宫组织，部分组织采用 4%多聚甲醛溶液固定，剩余组织置于-80℃冰箱保存。

2.3 一般状况观察 开腹后观察大鼠异位灶组织生长情况。

2.4 HE染色观察各组大鼠异位灶病理形态 大鼠组织切片按常规步骤处理后，采用苏木素和伊红染液分别进行细胞核和细胞质染色，显微镜下观察并进行图像采集。

2.5 Western blot测定p-PKCα、PKCα蛋白的表达 提取在位内膜及异位灶组织的总蛋白，测定蛋白浓度后，每组取等量蛋白变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白分离后，采用半干转膜仪将蛋白移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h后，采用相应一抗4℃孵育过夜。次日洗膜后，对应二抗孵育1 h，清洗后用化学发光系统进行凝胶成像。用Image J分析软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白/GAPDH的数值作为统计数据。

3 结果

3.1 各组大鼠异位灶情况观察 模型组异位灶明显，体积较大，表面血管丰富，与周围组织黏连严重；与模型组比较，中药组异位灶体积及血管网随剂量加大而逐渐减小；西药组也同样抑制异位灶的形成。见图1。

注：A.模型组；B.中药低剂量组； C.中药高剂量组；D.西药组

3.2 各组大鼠异位灶组织形态观察 HE结果显示，假手术组子宫内膜结构完整，高柱状上皮细胞整齐、紧密排列，腺体丰富；模型组异位内膜上皮细胞呈低柱状或乳头突起状，炎性细胞浸润及血管增生明显，腺体数量较少；各中药组和西药组的异位内膜均可见不同程度的萎缩，上皮细胞不完整，间质细胞小，腺体数目少，腺腔内有少量白细胞。见图2。

注：A.假手术组；B.模型组异位灶；C.中药低剂量组异位灶；D.中药高剂量组异位灶；E.西药组异位灶

3.3 各组大鼠在位内膜和异位灶中p-PKCα、PKCα蛋白水平的比较 模型组子宫在位内膜p-PKCα的蛋白表达水平高于假手术组(P<0.05)，具有统计学意义；中药高剂量组和西药组子宫在位内膜p-PKCα的蛋白表达水平低于模型组(P<0.05)，具有统计学意义，详见表1。

表1 各组大鼠在位内膜中 PKCα、p-PKCα蛋白相对表达量

中药高剂量组和西药组异位灶组织p-PKCα的蛋白表达水平低于模型组(P<0.05)，具有统计学意义，详见表2。各组大鼠子宫在位内膜和异位灶组织中PKCα的蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05)。详见表1、表2。

表2 各组大鼠异位灶中 PKCα、p-PKCα 蛋白相对表达量

4 讨论

EMs因人和病变部位的不同，临床表现各异，常表现为疼痛、不孕、月经异常等症状，严重影响女性的生活品质和健康。内异症虽然是良性病变，却具备侵袭、转移及复发等恶性行为，因其确切发病机制尚不明确，是目前临床常见的难治性妇科疾病[7]。故对本病发病机制及治疗手段的探索己成为妇科领域十分关注的问题。

中医古籍中并无EMs病名，但依据其临床表现，归属于中医“痛经”“癥瘕”“不孕”等范畴。中医学者认为“血瘀”是EMs的病理基础，众多医家从不同角度对EMs“血瘀证”的病机进行了探讨和研究，丰富了内异症的病机学说。瘀血阻于冲任、胞宫，为本病的基本病理特点，“久病及肾”，易致肾虚；临床常表现为下腹部畏寒喜暖、甚至腰以下冰冷，当属虚寒。肾阳不足，虚寒内生，寒客胞宫，血与寒凝，瘀血阻于冲任，致使冲任气血失调，离经之血凝集，而发生内异症[8]。

近年来，中医药治疗EMs取得了很多进展。连方等采用祛瘀解毒法[9]，魏郁清等采用补肾序贯结合活血化瘀法[10]，赵瑞华等采用活血化瘀法[11]能明显改善EMs抑郁焦虑患者临床症状。刘海燕等应用补肾祛瘀法分排卵期前和排卵期后治疗EMs不孕，患者妊娠率可得到有效提高[12]。全国名中医杜惠兰教授提出补肾温阳、祛寒化瘀为基本治法，并以此为理论指导，创立补肾温阳化瘀方应用于临床多年，临床疗效显著。对补肾温阳化瘀方进行临床研究，发现中药组患者在生理领域、心理领域、独立性领域、社会关系领域的评分均优于孕三烯酮对照组，可以明显改善患者的临床症状及生活品质，临床总有效率达73.33%～82%，可明显改善患者痛经、月经不调、经期腰骶痠痛、性交痛、性欲减退、形寒肢冷、神疲乏力等症状体征，且无明显副作用出现[13]。方中炮附子和桑寄生共为君药，二者共奏补火助阳、散寒止痛、补益肝肾之功；肉桂和狗脊共为臣药，加强温阳散寒止痛功效；小茴香、川芎、制没药等活血化瘀、理气止痛，共为佐药。药理学研究显示附子具有抗炎镇痛作用，对延缓EMs病灶形成及缓解疼痛均具有良好的疗效[14]，除此之外，桑寄生中的总黄酮[15]、狗脊的有效成分[16]、川芎的有效成分生物碱类[17]等均具有抗炎、镇痛作用。补肾温阳化瘀方可以降低异位内膜的黏附、侵袭、种植能力，抑制血管生成及神经生长、降低细胞自噬、改善乏氧状态从而抑制内异症的发展[18-22]。

现代研究认为，EMs的发病机制主要与基于肿瘤特征的侵袭和迁移、细胞增殖及凋亡等密切相关[23]。研究发现，PKC信号通路激活可以刺激血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和白细胞介素-8(IL-8)的基因表达来诱导子宫内膜修复[24]。采用基因芯片分析发现，在EMs基质细胞中PKCβ1表达增高[25]。在炎性痛和神经病理性疼痛模型中，PKC的表达上调[26]，通过瞬时感受器电位香草酸亚型1(TRPV1)通道改变电流，导致痛觉过敏[27]。课题组前期研究发现，补肾温阳化瘀方能够激活TRPV1通道[18]，因此我们猜测PKC通路的激活可能与EMs的疼痛症状相关。也有大量文献报道，中医药可通过核因子-κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt等多条信号通路改善EMs[28]。而PKC能调控MAPK/细胞外信号调节激酶(ERK)通路癌细胞的增殖与转移[29]、磷酸化的PKC可磷酸化NF-κB，进而促进炎症介质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等释放，导致疼痛的发生[30]。此可见PKC信号通路可能多途径参与EMs的发生。

在本研究中，笔者检测了各组大鼠在位内膜及异位灶中PKCα、p-PKCα蛋白的表达情况，结果显示，模型组的p-PKCα蛋白水平显著升高，经治疗后，治疗组的p-PKCα蛋白水平均有不同程度下降。综上所述，笔者认为补肾温阳化瘀方通过抑制PKC信号通路来治疗EMs，可能是通过PKC影响增殖、迁移、疼痛等，但还需进一步研究验证。