林下草地放牧河田鸡对林地土壤化学性状和微生物菌群的影响

高承芳,陈冬金,辛清武,应朝阳 (.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建 福州 35003;2.福建省农业科学院农业生态研究所/ 农业部福州农业环境科学观测实验站/ 福建省山地草业工程技术研究中心,福建 福州 35003)

福建省长汀县的河田鸡为全国优良的家禽品种,对地方经济发展有重要促进作用。河田鸡传统饲养方式为林下高密度、连续放养,在养殖密度过大的情况下,鸡在放牧的同时刨食地表植被、土壤,并破坏林地生物多样性,长期踩踏还会造成土壤板结、团粒结构破坏、土壤有机质(SOM)含量低、微生物失活等土壤退化问题,极易引发水土流失、山体滑坡,严重威胁了当地的经济与生态安全。因此,明确林下生态养殖河田鸡适宜的人工种草(组合)与合理放养密度[1],即通过林地种草进行合理密度放牧饲养河田鸡至出栏,适宜的密度为150 羽·hm-2,最适宜的林下牧草搭配组合为宽叶雀稗(Paspalumwettsteinii)、百喜草(Paspalumnotatum)、白三叶(Trifoliumrepens)等,但该模式对河田鸡整个放牧周期土壤生态环境造成的影响尚不清晰。

放牧通过改变草地群落的物种组成、生物多样性以及土壤理化性质等影响草地生态系统的结构和功能。林地种草与适宜的放牧强度能够保护生态环境,改善土壤理化性状,丰富土壤微生物多样性[2-4]。关于放牧对土壤微生物影响的研究越来越多,主要集中在微生物数量、生物量、活性、群落和多样性的影响等方面[5-8]。而放牧的强度、持续时间以及环境波动是放牧生态效应的主要影响因素,放牧时间的控制能够有效防止植食者对草地的伤害,防止土壤退化[8]。张晓玲等[9]研究表明,放牧时间的优化对草原群落的结构及生产力等具有一定的积极作用。

因此,该研究通过在典型林下放牧区,以传统养殖模式(林下自然生草放牧)为对照,研究林下人工种草放牧河田鸡在不同放牧时间对土壤化学性状、土壤微生物多样性的影响,明确林下人工种草放牧河田鸡模式对土壤生态环境的影响,优化放牧时间,旨在确定最佳放牧时间及放牧方式,为林下合理放牧、优化生态环境提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于福建省长汀县兰秀家庭农场内,以生长3～5 a的桂花(Osmanthusfraqrans)林作为试验基地(25°41 ′19″ N,116°25′5″ E,海拨315 m)。该地区属亚热带海洋性季风气候区,年均气温17 ℃～19.5 ℃,最高气温39.8 ℃,最低气温-4.9 ℃,年无霜期265 d,年降水量1 700 mm,试验前土壤w(SOM)为13.127 g·kg-1,w(TN)为0.467 mg·g-1,w(NO3--N)为8.67 mg·kg-1,w(NH4+-N)为2.147 mg·kg-1,w(AP)为5.94 mg·kg-1,w(AK)为113.2 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验小区平均分为18组,包括林下自然生草放牧(A)与林下人工种草放牧(B),每组设3个不同放牧时间,分别为30、60 和90 d,各放牧小区重复3次,各小区面积均为300 m2,小区之间用高2.5 m的钢丝网隔开,防止鸡来回窜动。试验前对试验区林地进行调查分析,将各小区设置在地形基本一致的地段上。放牧结束后将鸡赶到备用小区,继续放牧至120 d龄出栏,备用小区为试验小区外的林地,采用自由放牧。

A组(对照组)草地不经任何处理,自然植被以芒萁(Dicranopterisdichotoma)、孔颖草(Bothriochloapertusa)、狗尾草(Setariaviridis)、牛筋草(Eleusineindica)为主;B组进行土壤翻耕,种植宽叶雀稗、百喜草、白三叶、紫花苜蓿(Medicagosativa)为优势种的人工草地,草地播种时间为2019年4月,待草地封垄后,覆盖度>50%、整体自然高度>30 cm时进行放牧(放牧时间为2019年6月22日)。

选取体重均匀〔(397.3±13.8) g〕的(30±2 ) d的河田鸡1 206 羽,放牧密度为67 羽·(300 m2)-1。每天的放牧时间为08:00到17:00,整个放牧期间配套充足的水,补饲肉鸡全价颗粒饲料,统一饲养管理,鸡粪和排泄物回归草地。各小区放牧结束后次日进行林地土壤样品的采集。

取样方法参照文献[10],利用取土钻以放牧小区为单位取样,每个小区内梅花点布局,5点法取样,取土深度为0～20 cm,取土面积1 m×1 m,将5个点土样捡出砾石、植物根系等杂物混合后分成2组,一组分析土壤化学性状,另一组用于检测土壤微生物。用于分析土壤化学性状的土壤进行自然风干,过2 mm 孔径筛后装入自封袋,进行SOM、TN、AP、AK、NO3--N和NH4+-N含量测定;取约50 g直接装入无菌袋内,放入-80 ℃冰箱里保存备用,用于检测土壤微生物。

1.3 检测项目及方法

土壤理化性状:参照文献[10],采用水合热重铬酸钾氧化-比色法测定土壤SOM含量,凯氏定氮法测定TN含量,0.5 mol·L-1NaHCO3法测定AP含量,火焰光度法测定AK含量,水溶法测定pH值,酚二磺酸比色法测定NO3--N含量,KCl浸提-蒸馏法测定NH4+-N含量。

土壤微生物检测:将上述放在-80 ℃冰箱的土壤样品送至北京奥维森基因科技有限公司进行16S V3-V4区土壤细菌微生物检测。首先,提取土壤DNA 进行PCR扩增,构建Miseq文库,获知模板DNA片段的序列,进行数据质控及OTU基础分析。

1.4 数据质控及OTU基础分析

数据处理过程和参数:Miseq测序后得到双端序列数据,对测得的Fastq数据进行过滤处理,最终得到优质的Fastq数据。具体操作流程利用Trimmomatic、Pear对Fastq数据进行质控,利用Flash、Pear根据PE的overlap关系对两端序列进行拼接处理,根据已知数据库用Uchime方法比对去除Fasta序列的嵌合体。

OTU分析:经有效数据统计与优质序列长度分析后,进行OTUs聚类分析。用Uclust按照97%相似性将全部序列聚类[11-12],绘制出所有样本共有和特有的OTU分布Venn图。

物种注释及分类学分析:采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析,并在(界、门、纲、目、科、属、种)各个水平注释其群落的物种信息,得到每个OTU对应的物种分类信息。

α多样性指数(D)计算公式为

(1)

式(1)中,D为估计的OTU数;Sobs为观测到的OTU数;n1为只有1条序列的OTU数目;n2为只有2条序列的OTU数目。

辛普森多样性指数(S)计算公式为

S=∑(Ni/N)2。

(2)

式(2)中,Ni为某一特定物种的个体总数;N为所有物种的个体总数。S值越小,说明群落多样性越高。

香农威纳多样性指数(W)计算公式为

W=-∑PilnPi。

(3)

式(3)中,Pi为第i种的个体占比,%。

1.5 数据统计与分析

利用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析。利用二因素试验统计分析(one-way ANOVA,LSD)及Tukey多重比较方法进行显著性检验。数据用平均值±标准差(SD)表示。采用Pearson相关系数评价土壤化学性状与优势菌种间的相关关系。

2 结果与分析

2.1 不同放牧时间及放牧方式对林地土壤化学性状的影响

由表1可知,放牧方式对土壤化学性状的影响较大,B组土壤SOM、TN、AP、AK、NO3--N与NH4+-N含量均显著或极显著高于A组(P<0.01或P<0.05)。随着放牧时间增加,相同放牧方式的SOM、TN含量均呈逐渐增加趋势,AP含量呈现先上升后下降趋势,均在60 d的放牧组达最高值,NO3--N与NH4+-N含量随着放牧时间的延长呈下降趋势。

表1 不同放牧时间及放牧方式对林地土壤化学性状的影响Table 1 Effects of grazing on soil physical and chemical properties in the different grazing time and model

2.2 不同放牧时间及放牧方式对林地土壤细菌微生物多样性的影响

测序深度数值指随测序深度的增加实际观测到的OTU个数;观测深度数值越高,样本中序列被测出的概率越高;谱系多样性和香农威纳多样性指数越大,多样性越高;菌种丰富度指数主要用于估计群落样品中包含的物种总数,能很好地反映群落中低丰度物种的存在情况;辛普森多样性指数值越大,群落多样性越高。

由表2可知,观测深度均在0.9以上,说明6个样本中OTU序列被测出的概率均较高,能够代表此次测序微生物的真实情况。放牧方式对土壤细菌微生物多样性的影响较大,整体变化趋势为放牧60和90 d的B组测序深度、观测深度、谱系多样性、菌种丰富度指数、香农威纳多样性指数、辛普森多样性指数高于A组。而相同放牧方式下,随着放牧时间的延长,测序深度、谱系多样性、菌种丰富度、香农威纳多样性指数和辛普森多样性指数在B组间变化幅度不大,均无显著差异(P>0.05);A组间除观测深度呈现下降趋势外,其余指标均呈明显上升趋势,组间差异达极显著水平(P<0.01)。

表2 不同放牧时间及放牧方式对土壤细菌微生物多样性的影响Table 2 Effects of grazing on soil bacterial diversity in the different grazing time and model

2.3 不同放牧时间及放牧方式对林地土壤细菌微生物群落组成及相对丰度的影响

A组与B组差异性物种有13个门(表3)。B组相对丰度较高的种群为变形菌门(Proteobacteria),30、60和90 d的放牧时间组分别为35.3%、38.6%和35.1%;其次是酸杆菌门(Acidobacteria),分别为20%、22.7%和22.1%;放线菌门(Actinobacteria)分别为9.9%、12.2%和14.0%,绿弯菌门(Chloroflexi)分别为9.3%、9.3%和6.5%,厚壁菌门(Firmicutes)分别为8.2%、1.8%和5.2%,拟杆菌门(Bacteroidetes)分别为3.5%、2.1%和6.6%,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)分别为3.3%、4.0%和3.2%。A组相对丰度较高的为变形菌门(Proteobacteria),30、60和90 d的放牧时间组分别为28.4%、31.9%和30.3%,酸杆菌门(Acidobacteria)分别为20.1%、19.6%和11.8%,绿弯菌门(Chloroflexi)分别为19%、18.1%和8.7%,放线菌门(Actinobacteria)分别为14.7%、1.0%和19.8%,拟杆菌门(Bacteroidetes)分别为7.5%、2.8%和10.7%,厚壁菌门(Firmicutes)分别为1.8%、4.0%和7.8%。

表3 不同放牧时间及放牧方式对土壤细菌微生物在门水平上相对丰度的影响Table 3 Effects of grazing on relative abundance of soil bacterial microorganisms at the phylum level in the different grazing time and model

相同放牧方式下,随着放牧时间的延长,A组土壤放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度为90 d>30 d>60 d,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)为90 d>60 d>30 d,酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)为30 d>60 d>90 d,变形菌门(Proteobacteria)为60 d>90 d>30 d。B组放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度为90 d>60 d>30 d,拟杆菌门(Bacteroidetes)为90 d>30 d>60 d,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)为60 d>30 d>90 d,酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)为60 d>90 d>30 d,硝化螺旋菌门(Nitrospirae)为30 d>60 d>90 d,绿弯菌门(Chloroflexi)为30 d=60 d>90 d,厚壁菌门(Firmicutes)为30 d>90 d>60 d。

2.4 不同放牧时间及放牧方式下土壤细菌微生物群落的组间差异性

通过LEfSe进化分支分析,发现组间具有显著差异的生物标记(Biomarker)以及显著影响组间差异性的物种或群落[13]。

不同放牧时间对微生物影响较大,差异物种丰富度从大到小排序为A90>A30>B60>A60>B90>B30。A90分别在拟杆菌门(Bacteroidetes)的拟杆菌纲(Bacteroides)、鞘脂(sphingolipid),放线菌门(Actinobacteria)的放线菌纲(Actinobacteria),变形菌门(Proteobacteria)的变形菌纲(Proteobacteria),厚壁菌门(Firmicutes)的梭菌纲(Clostridia)等水平上差异显著(P<0.05)。A30在绿弯菌门(Chloroflexi)的酮菌纲(ketobacteriae)、JG37-AG-4纲,拟杆菌门(Bacteroidetes)的鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia),酸杆菌门(Acidobacteria)的酸杆菌纲(Acidobacteria),放线菌门的放线菌纲(Actinobacteria)等水平上差异显著(P<0.05)。B60在芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的芽单胞菌纲(Blastomonas)、变形菌门(Proteobacteria)的甲型变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)等水平上差异显著(P<0.05)。A60在GAL15门、酸杆菌门的Subgroup_2小群和绿弯菌门(Chloroflexi)的酮菌纲(Ktedonobacteria)等水平上差异显著(P<0.05)。B90在Parcubacteria门、酸杆菌门(Acidobacteria)的独杆菌纲(Solibacteres)和变形菌门(Proteobacteria)的根瘤菌目(Rhizobiales)等水平上差异显著(P<0.05)。B30在厚壁菌门(Firmicutes)的芽胞杆菌目(Bacillales)和变形菌门(Proteobacteria)的红螺菌目(Rhodospirillales)等水平上差异显著(P<0.05)。

2.5 不同放牧时间及放牧方式的林地土壤细菌微生物与土壤化学性状关联分析

放线菌门、酸杆菌门是土壤中主要进行物质分解的微生物菌门,变形菌门负责固氮,硝化螺旋菌门影响硝化过程。由表4可知,土壤化学性质在水平方向上影响着细菌主要功能菌群的组成及结构变化,SOM含量与酸杆菌门呈极显著正相关,与绿弯菌门呈极显著负相关。TN含量与变形菌门呈显著正相关,与绿弯菌门呈极显著负相关。AP含量与放线菌门呈显著正相关,与绿弯菌门呈极显著负相关。AK含量与芽单胞菌门呈极显著正相关,与变形菌门呈显著正相关,同样与绿弯菌门呈极显著负相关。NO3--N含量与厚壁菌门呈极显著正相关,与硝化螺旋菌门呈显著正相关。NH4+-N含量与放线菌门呈显著正相关。

表4 土壤化学性状与细菌微生物关联性分析表(门水平)Table 4 Correlation analysis diagram of soil environmental factors and soil bacteria (on the phylum level)

3 讨论

3.1 不同放牧时间及放牧方式对土壤化学性状的影响

对于放牧的研究大多与土壤微生物和土壤理化性状结合起来,它能快速评价土地结构状况,能较早提示草地生态环境和生态系统功能的变化[14-16]。自由放牧已被证明可以改变土壤结构和土壤养分[17],主要是通过畜禽的采食、排泄及活动影响草地土壤化学性质的变化。研究采用林下自然生草与林下人工种草2种放牧方式,鸡排泄物回归草场,鸡的采食与活动影响了土壤的变化。

有机质作为土壤最重要的组成部分,是土壤中各种营养元素,特别是氮、磷的重要来源。研究发现,土壤化学性状受放牧方式的影响较大,尤其是林下人工种草放牧组土壤中SOM、TN、AP、AK、NO3--N和NH4+-N含量显著高于林下自然生草放牧组,但AP含量有所不同。受到人工种草干预的影响,土壤化学性状指标有所改善,可能的原因是林地种草后所产生的凋落物和根系分泌物有所不同,致使释放的有机质不同,再加上豆科牧草的固氮作用,提高了土壤有机质与全氮含量。曲同宝等[15]报道,生草能显著提高不同土层土壤有机质及氮、磷、钾养分的含量。苟燕妮[16]发现,橘园行间生草能显著提高土壤SOM含量,改善土壤氮、磷、钾的供应。因此土壤化学性状的变化与林地生物环境密切相关。

不仅如此,随着放牧时间的延长,土壤SOM、TN含量趋于丰富。这可能是由于:(1)放牧动物的踩踏压实,影响到土壤通气、氧化还原状态和土壤持水能力,在适度放牧密度下放牧时间延长,土壤结构与土壤通气性改善,土壤化学性状积累较快,从而使土壤氮循环加速,土壤氮含量增加。(2)家畜通过采食活动加快营养物质的转化、排泄物归还提高土壤营养物质等途径影响草地氮素的循环,加快草地凋落物的分解速度,促进土壤有机质与含氮化合物的积累[18]。(3)动物粪便和尿液的归还会改变土壤有机质和矿质氮的含量[19-20]。闫钟清等[21]报道,土壤全氮含量随放牧强度加剧而增加,可能是由于重牧区家畜粪便多,提供大量的有机氮源,从而导致土壤中全氮、有机质含量增加。

AP含量随着放牧时间增长呈现出先升后降趋势,在放牧60 d达到最高值。这同样是受到河田鸡频繁采食践踏的影响,加快了养分从系统中输出的速度,再加上一些牧草品种根系较发达,能把土壤中较深层的难溶磷钾矿物分解吸收出来,然后集于表层土壤中,因此在放牧60 d时达最高峰。随着放牧时间继续延长,土壤负担加重,土壤AP含量反而下降。土壤AK含量受到放牧强度、地理环境(温度、水分等)以及植物吸收的影响,导致土壤结构改变,从而影响AK的缓冲能力[21]。随着放牧时间延长,AK含量在林下自然生草放牧组呈上升趋势,在林下人工种草放牧组趋于稳定。这是因为放牧家畜粪便的大量输入大大增加了土壤AK含量,基于人工种草草地中植被对有效养分的吸收消纳,使得AK含量趋于稳定。

NO3--N与NH4+-N含量受放牧时间的影响较大,在A组与B组间均呈现下降趋势。这是因为随着草食动物的踩踏、卧息等活动,土壤容重增加,草地土壤形成了厌氧环境,反硝化作用增强[22-23],从而使土壤NO3--N与NH4+-N含量随放牧时间增长而下降。

3.2 不同放牧时间及放牧方式对土壤微生物多样性与菌群结构的影响

土壤微生物作为评价土壤质量和健康状况的重要指标之一,在土壤形成与发育过程中起着重要作用。土壤微生物受到放牧过程中牲畜的采食、踩踏、排泄等活动影响而发生变化[7,24-25]。放牧可调节土壤微生物群落的多样性和群落组成[20,26-29],适度的放牧可增加土壤微生物多样性[30]。研究比较了2种放牧方式下土壤细菌微生物的变化情况,林下自然生草放牧组林地植被多为芒萁、茅草等禾本科类植物,而林下人工种草放牧组牧草种类丰富,包括禾本科与豆科等牧草。鸡在采食过程中会优先选择豆科牧草及其他细嫩牧草,牧草种类的变化直接影响土壤微生物的变化。再加上放牧活动对土壤微生物群落的影响[31],牲畜采食植被地上部分,并将其粪便返回林地[32],更有利于细菌生长。这就导致了A组与B组间变化不一致,香农威纳指数在A组间表现出逐渐上升的趋势,而在B组间则相反。受放牧时间的影响,土壤微生物多样性在B组间变化幅度不大,但在A组间,随着放牧时间延长,观测深度、谱系多样性、微生物多样性、香农威纳指数和辛普森多样性指数均呈明显上升趋势。这是因为林下人工种草放牧组经过人工干预后,草地结构发生改变,土壤结构、通气性等都有所改善,改变了土壤结构状态,改善了土壤微生态环境,致使土壤微生物多样性更敏感,微生物多样性不会随着放牧时间的变化而变化,一直处于平稳的优势状态,这一结果与文献[32-33]一致。影响微生物菌群结构的主要因子是草地类型[34],受土壤中强大的根系影响,土壤微生物多样性优势菌群发生改变[35]。植物通过根系分泌物影响土壤微生物群落,从而改变土壤细菌组成[36]。林下自然生草放牧组在放牧后期土壤遭受频繁踩踏,通气性变差,土壤紧实度增加,土壤含氧量降低,从而降低了细菌对易分解物质的分解速率[37],以放线菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门等为优势菌群,放线菌门是一类厌氧消化反应器中具有重要功能的革兰氏阳性细菌类群,它和绿弯菌门在有机物分解和营养循环中发挥了重要作用[38],但有少数放线菌是致病菌,易引起放线菌病。拟杆菌门和厚壁菌门广泛存在于土壤中,大多数植物致病菌属于厚壁菌门,一般是在土壤贫瘠、养分不充分的条件下产生的[39]。它们在营养物质更丰富的土壤中较其他微生物类群更缺乏竞争力,是3种荒漠类型中的优势类群[40]。研究表明,林下人工种草放牧组土壤优势种群为芽单胞菌门、变形菌门、酸杆菌门。酸杆菌门是土壤菌群里的最重要的一类微生物,大多属于寡营养型类群。它们是嗜酸菌,在生态系统中具有重要作用,在土壤中参与降解植物残体多聚物,参与铁循环,具有光合能力等[41-42]。NEMERGUT等[43]研究发现,酸杆菌门的丰富度随土地利用年限的增加而增多。变形菌门属富营养型类群,主要参与有机质分解[44]。

3.3 土壤微生物与土壤化学性状的相关性分析

土壤微生物群落组成与土壤养分含量、理化性状等因素密切相关[30,33]。FIERER等[45]发现,施氮量对细菌多样性没有产生显著影响,但施氮对细菌群落结构影响显著,富营养细菌、变形菌门与拟杆菌门上升,而寡营养细菌酸杆菌却表现出相反趋势。TN含量与变形菌门呈显著正相关,与绿弯菌门呈极显著负相关。研究表明,若尔盖高寒草甸土壤微生物含量与SOM含量存在显著正相关关系[46-47]。苟燕妮等[16]提出,土壤微生物与土壤SOM和TN含量呈较强的正相关关系。酸杆菌与土壤SOM含量呈正相关[48-49],放线菌门与 NH4+-N含量呈显著正相关[50]。

4 结论

研究揭示了不同放牧时间及放牧方式对土壤化学性状与土壤微生物菌群的影响。受放牧方式的影响,林下人工种草放牧组土壤SOM、TN、AP、AK、NO3-N与NH4+-N含量均显著高于林下自然生草放牧组;随着放牧时间增加,土壤SOM、AK含量呈逐渐增加趋势,AP含量呈先上升后下降趋势,NO3-N与NH4+-N含量则呈下降趋势。林下人工种草放牧组土壤微生物多样性受放牧时间影响较小,多样性相对稳定,以芽单胞菌门、变形菌门、酸杆菌门等菌群占主导地位;而林下自然生草放牧组土壤微生物多样性呈上升趋势,但增加了放线菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门等菌群。

在实际生产中,建议在林下放牧河田鸡时采用林下人工种草划区轮牧,轮牧时间以60 d最为适宜。