伸展摇蚊(Chironomus tentans)转录组测序及胰岛素信号通路关键基因序列分析

张成林,古 文,汪 贞,石利利,王 蕾①,杨家新 (1. 南京师范大学海洋科学与工程学院,江苏 南京 1003;. 生态环境部南京环境科学研究所,江苏 南京 10033)

摇蚊(Chironomidae)属昆虫纲双翅目长角亚目摇蚊科,是完全变态昆虫,生命周期包括卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段。幼虫时期又可细分为4个龄期,占据生活史时间最长。幼虫主要生活在水体沉积物表层,可用于检测水体沉积物的受污染情况[1]。因具有易饲养、繁殖量大、变态发育特征明显、生命周期短等特征,摇蚊已被经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)列为无脊椎动物内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)测试的模式生物[2-3]。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将EDCs定义为能改变机体内分泌功能,并对生物体及后代或种群产生不良影响的外源性化合物或混合物[4],目前各国对EDCs的筛选与测试多集中在脊椎动物,2012年OECD新增摇蚊进入EDCs测试评估框架的第四、五级测试层级模式生物,但研究内容主要停留在性别比、产卵率、羽化率、羽化时长等个体水平的毒性终点,并未从分子水平上揭示内分泌干扰机理[5-7]。筛选无脊椎动物内分泌干扰性的分子生物标志物、识别可能的致毒通路已成为环境EDCs筛查的关键技术问题[8]。据此,欧盟已将无脊椎动物内分泌干扰性机理和方法研究纳入优先研究领域[9]。

与脊椎动物内分泌调节方式不同,昆虫生长发育主要受胰岛素、保幼激素和蜕皮激素3种内分泌激素的调节[10]。其中,胰岛素是重要的营养调节信号,对昆虫的繁殖、生长、发育、寿命、代谢等生命过程都有关键调控作用[11]。去除合成胰岛素的神经分泌细胞可导致果蝇发育延迟和生长缓慢[12]。除直接作用外,胰岛素还能与蜕皮激素、保幼激素等途径互作、协同调控昆虫生长发育和繁殖。研究表明,牛胰岛素处理可促进埃及伊蚊(Aedesaegypti)分泌蜕皮激素进而改变其发育历期[13]。尖音库蚊(Culexpipiens)、埃及伊蚊的相关研究证实,胰岛素还可调控保幼激素的分泌并促进卵巢发育[14-15]。在注射胰岛素类似物后,大草蛉(Chrysopapallens)的卵巢发育、卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)的合成均得到促进[16]。

胰岛素信号通路广泛存在于生物体内,其主要调控基因的结构与功能相对保守[17]。胰岛素信号通路主要通过PI3K-Akt途径发挥自身生理功能[18]:随体液运输到细胞外的胰岛素与位于细胞膜上的胰岛素受体(insulin receptor,InR)相结合,InR被磷酸化后激活,将胰岛素信号传递到细胞内部。胰岛素信号在进入细胞内部后主要经由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)信号途径继续向下传递,目前关于昆虫胰岛素信号通路方面的研究也多集中在PI3K-Akt信号途径[19]:PI3K是由p85调节亚基与p110催化亚基组成的异二聚体,PI3K的p85调节亚基与上游经InR磷酸化激活的胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)结合后可活化p110催化亚基,使磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)转换为磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-phosphate,PIP3),由PIP3活化的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(3-phosphoinositide dependent kinase,Pdk)继续磷酸化Akt[20],被磷酸化激活的Akt进入到细胞质中并调控如叉头转录因子O家族(forkhead transcription factor O, FoxO)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK3)等下游基因的活性来行使调节功能[21]。

胰岛素信号通路中的InR、Pdk、Akt、FoxO已被证实对昆虫生长发育及繁殖过程有重要影响[22]。在褐飞虱(Nilaparvatalugens)中,通过RNAi抑制InR基因的表达影响了幼虫蜕皮和蛹的羽化,降低了成虫卵子的产生和孵化率,敲低Pdk、Akt会导致褐飞虱短翅表型的增加,沉默FoxO则会导致长翅型的出现[23]。缺失Pdk基因导致果蝇胚胎死亡,过表达Pdk和Akt则可以在PI3K依赖的条件下增加细胞和器官的大小[24]。InR的敲低会造成长红锥蝽(Rhodniusprolixus)卵黄原蛋白的积累、卵巢质量减小且产卵量降低[25]。尽管如此,目前摇蚊胰岛素信号通路关键基因的序列信息尚未揭示,阻碍了基于胰岛素信号通路的内分泌干扰作用机理的研究。

笔者以我国广布种伸展摇蚊(Chironomustentans)为研究对象,在开展转录组测序的基础上,筛选出胰岛素信号通路关键基因序列并开展RACE基因全长扩增,预测并验证了基因序列的开放阅读框(open reading frame,ORF),对相关氨基酸序列进行了生物信息学分析和基因同源比对,最后检测了相关基因在不同发育阶段(Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄、Ⅳ龄幼虫,蛹期,雌性成虫,雄性成虫)伸展摇蚊中的相对表达量,为基于胰岛素信号通路的内分泌干扰性机理研究提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 供试生物饲养

伸展摇蚊(Chironomustentans),养殖于曝气48 h以上的除氯自来水中,保持水体温和曝气,每日喂食1次粉末状饲料(饲料品牌为“鱼乐园水族”,主要成分为进口白鱼粉、肝末粉、酵母粉、虾红素、天然免疫剂、蛋氨酸、赖氨酸、微量元素等),保持光暗比为10 h∶14 h,温度(23±1)℃。试验开始时供试生物已在实验室连续培育10代以上。

1.2 总RNA提取与第一链cDNA的逆转录合成

收集伸展摇蚊全部发育阶段(卵、Ⅰ～Ⅳ龄幼虫、蛹期、雌雄成虫)正常个体混合后作为样本。用吸水纸除去多余水分后立即进行液氮速冻,采用Trizol法对样本进行总RNA提取,获得的总RNA则暂存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)进行逆转录操作,取1 μL提取的总RNA作为模板,先后加入1 μL 100 μmol·L-1的Oligo (dT)引物和10 μL的经焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)处理过的DEPC水,混合均匀后于65 ℃条件下温育5 min并立即浸入冰水1 min降温。再在反应液中依次加入4 μL 5X反应缓冲液、1 μL RiboLock RNA酶抑制剂、2 μL 10 mmol·L-1dNTP mix、1 μL RevertAid M-MuLV逆转录酶,摇晃混匀后短暂离心,于42 ℃条件下反应1 h,再在70 ℃条件下放置5 min以结束反应。逆转录获得的cDNA可在-20 ℃条件下暂存。

1.3 转录组单基因序列库的建立

委托南京集思慧远生物科技有限公司进行cDNA高通量测序,获得cDNA片段两端的序列(Reads)。对测序得到的cDNA片段进行组装,从而获得伸展摇蚊的转录本(mRNA)序列并构建出伸展摇蚊的单基因序列库,基于单基因序列库进行基因结构注释、基因功能注释等一系列生物信息学分析。

1.4 RACE基因克隆与测序

从实验室的伸展摇蚊单基因序列库中提取出胰岛素信号通路中的4个基因(InR、Pdk、Akt、FoxO)相关序列信息,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。以伸展摇蚊的cDNA为模板进行PCR扩增,反应体系为:5.0 μL cDNA模板、正反向引物各1.5 μL、2X Ex taq Buffer (takara) 25.0 μL、dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL、Ex taq (takara) 1.0 μL、15.0 μL无核酶DEPC水;反应条件为:94 ℃预变性2 min,94 ℃ 30 s变性、55 ℃ 30 s复性、72 ℃ 60 s延伸,设置35次循环,72 ℃ 10 min延伸以获得最终产物,PCR产物以0.01 g·mL-1的琼脂糖凝胶进行电泳检测,电压120 V,电泳0.5 h。切割下含有目的基因的胶条,以胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段,具体方法按试剂盒说明书进行,送往转导生物实验室进行RACE基因克隆实验,拼接、测序后获得基因全长,预测开放阅读框(open reading frame,ORF)并进行PCR验证。

表1 伸展摇蚊胰岛素信号通路基因扩增引物序列Table 1 Primer sequences used for cloning and quantitative of genes in C. tentans

1.5 目的基因氨基酸序列的生物信息学分析

利用DNAstar等软件对预测得到的ORF进行氨基酸序列推导,并分析各基因编码蛋白的分子量、等电点等信息。利用在线软件SMART(http:∥smart.embl.de)对氨基酸序列进行了保守结构域的推导。运用DNAMAN软件进行多物种比对。借助MEGA 11软件以近邻相接法(neighbor-joining)构建各基因氨基酸序列的系统发育树,各分支采用自助抽样法(bootstraps method)进行1 000次重复检验。

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

收集伸展摇蚊Ⅰ～IV龄幼虫、蛹、雌性成虫、雄性成虫的正常存活个体进行qRT-PCR,了解胰岛素通路基因在不同发育阶段的表达模式。前处理方法同1.2节。利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计,以GADPH为内参基因(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。利用Genious 2×SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒进行qRT-PCR操作,反应体系(20 μL)为:SYBR Premix Ex Taq(2×)试剂10 μL、正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL、各样本cDNA模板1 μL、去离子水7 μL。PCR扩增的反应条件设置为:95 ℃预变性5 min,循环1次;95 ℃变性10 s;60 ℃延伸30 s,循环40次。采用 2-△△Ct法对数据进行相对定量分析,差异显著性用IBM SPSS Statistics 19软件中的单因素方差分析(LSD)法计算(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 转录组测序

通过高通量测序仪测序共获得55 456 284条伸展摇蚊原始测序序列(raw reads),共8.32 G。 去除低质量测序序列后剩余的54 142 666条高质量测序序列被拼接为31 546条转录本(transcript),并提取出22 882条单基因序列(unigene),这些序列长度从201到13 746 bp不等,平均长度为938 bp。将22 882条单基因序列与多个公共数据库(swiss-prot、nr、Pfam、KOG、GO、KEGG)里的蛋白比对,通过序列相似性进行功能注释。有8 819条单基因序列可被注释到swiss-prot数据库中,12 777条单基因序列与nr数据库中蛋白序列同源,此外还分别有9 808、10 074 条单基因序列与Pfam数据库、KOG数据库中记载的蛋白序列具有良好的同源性。8 137条注释到GO数据库中的单基因序列在生物过程(biological progress)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3类中,转录(transcription)、细胞(cell)和结合(binding)是最主要的类别,这与其余昆虫类似(图1)。

图1 伸展摇蚊转录组序列GO分类图Fig.1 Histone representation of GO of C. tentans

共有7 130条单基因序列可与KEGG数据库中蛋白比对上,其中4 333条单基因序列被映射到了254条KEGG通路中,3 171条单基因序列参与了116条代谢(metabolism)相关通路,1 394条单基因序列被映射到41条生物体系统(organismal systems)通路中,17条细胞过程(cellular processes)通路也被注释到1 149条单基因序列,其余单基因序列分散在人类疾病(human diseases)、遗传信息加工(genetic information processing)、环境信息加工(environmental information processing)通路中。映射到胰岛素信号通路的单基因序列共有133条,超过21条集中在PI3K-Akt途径中(表2)。

表2 伸展摇蚊转录组中感兴趣基因Table 2 Unigenes of interest of C. tentans transcriptome

2.2 胰岛素信号通路基因全长与氨基酸序列分析

InR是一种酪氨酸激酶受体(PTK),其氨基酸序列具有很高的保守性[26]。InR是胰岛素的直接作用靶点,作为一种跨膜蛋白,可以接收来自外界的胰岛素信号并级联转导到细胞内部[27]。检测结果表明,伸展摇蚊InR基因的ORF全长为4 311 bp,CG含量为36.93%;推导出该序列编码1 436个氨基酸(图2),其中亮氨酸(Leu)含量最高,为121个,其次为天冬氨酸(Asp),含有100个;预测的分子量为162.48 kD;理论等电点为5.67,带负电的氨基酸残基(Asp+Glu)总数为190,带正电的氨基酸残基(Arg + Lys)总数为159;亲水性平均值为-0.395;对推导出的氨基酸序列进行SMART分析,确定了4个保守结构域:3个FN3 结构域(第579～679、696～901、925～1 016个氨基酸)和1个TyrKc 结构域(第1 094～1 363个氨基酸)。

图2 伸展摇蚊InR、Pdk、Akt、FoxO基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of InR, Pdk, Akt and FoxO from C. tentans

Pdk是胰岛素信号通路PI3K/Akt途径中的关键因子,负责Akt的激活,其氨基酸序列在人、黑腹果蝇及秀丽隐杆线虫等多物种中表现出高度保守性[28]。检测结果表明,由RACE基因克隆获得的伸展摇蚊Pdk基因全长为2 124 bp,推测ORF长为1 413 bp,CG含量为31.84%。推导出该序列编码470个氨基酸(图2),其中亮氨酸含量最高,为49个,其次为赖氨酸(Lys)与丝氨酸(Ser),分别含有45和38个。预测的分子量为54.71 kD,理论等电点为7.21,带负电的氨基酸残基总数为66,带正电的氨基酸残基总数为66,亲水性平均值为-0.533。对推导出的氨基酸序列进行SMART分析,确定了2个保守结构域,分别为S_TKc 结构域(第6～293个氨基酸)和PH 结构域(第376～465个氨基酸)。

Akt在被PI3K-Pdk激活后,会继续激活多种下游蛋白,从而调节多种生命活动[29]。检测结果表明,RACE基因克隆实验得到的伸展摇蚊Akt基因全长为4 277 bp,验证所得的ORF含1 563 bp,CG含量为34.74%;推导出该序列编码520个氨基酸(图2),含量最多的为亮氨酸,有45个,其次为谷氨酸(Glu)与丝氨酸,分别含有39和38个;预测的分子量为60.01 kD,理论等电点为5.97,带负电的氨基酸残基总数为71,带正电的氨基酸残基总数为64。亲水性平均值为-0.424。对推导出的氨基酸序列进行SMART分析,确定了3个保守结构域:PH 结构域(第28～131个氨基酸)、S_TKc 结构域(第183～440个氨基酸)以及S_TK_X 结构域(第441～506个氨基酸)。

FoxO是Akt的重要靶点之一,活化的Akt会磷酸化FoxO使其失活,从而将FoxO限制在细胞质中,无法发挥作用[30],若胰岛素信号通路受阻,FoxO无法被磷酸化,游离在细胞质中的FoxO便会进入到细胞核中,抑制细胞的正常分裂并加速细胞的凋亡[31]。检测结果表明,伸展摇蚊FoxO基因经RACE基因克隆、拼接得到的序列全长为3 343 bp,经验证ORF含有1 569 bp,CG含量为39.90%;推导出该序列编码522个氨基酸(图2),其中丝氨酸(Ser)含量最高,为62个,其次为天冬酰胺(Asn),有55个;预测的分子量为57.80 kD,理论等电点为5.45,带负电的氨基酸残基总数为53,带正电的氨基酸残基总数为39。亲水性平均值为-0.801。对推导出的氨基酸序列进行SMART分析,确定了1个保守结构域,为FH 结构域(第91～180个氨基酸)。

2.3 同源性分析与系统发育树构建

利用BLAST在线软件(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对伸展摇蚊InR基因编码的氨基酸序列进行同源比对发现,伸展摇蚊与岸溪摇蚊的一致性最高,达91.09%,与范氏多足摇蚊、埃及伊蚊的一致性分别为68.42%、45.94%(表3),多物种比对一致性仍有58.81%(图3),说明InR基因氨基酸序列在近缘物种间具有高度保守性。采用邻接法构建系统发育树,伸展摇蚊与岸溪摇蚊聚类为同一分支,并与鳞翅目的家蚕、甜菜夜蛾距离最为接近,与同翅目的稻褐飞虱、直翅目的东亚飞蝗同源性则较低(图4)。

以MEGA的NJ邻近法构建系统发育树,节点上数值代表自举检验值,重复运行1 000次。

表3 伸展摇蚊氨基酸序列同其他已知蚊虫相应氨基酸序列的同源性比对Table 3 Homology comparison of amino acid sequence between C. tentans and other mosquitoes

Blast同源序列比对显示,伸展摇蚊Pdk编码的氨基酸序列与岸溪摇蚊、范氏多足摇蚊、白纹伊蚊的一致性分别为94.26%、58.70%、45.75%(表3),多物种比对一致性可高达66.43%(图3),说明Pdk基因氨基酸序列在生物进化过程中相对保守。根据邻接法构建系统发育树的分析结果,伸展摇蚊与埃及伊蚊最为接近,并与同属于双翅目的黑腹果蝇、桔小实蝇聚为一支,与鞘翅目、鳞翅目昆虫关系较近,与半翅目的豌豆蚜、膜翅目蜜蜂科昆虫的同源性关系依次渐远(图4)。

Akt编码的氨基酸序列在多物种中进行比对发现,伸展摇蚊与岸溪摇蚊、范氏多足摇蚊、白纹伊蚊显示出高度一致性,分别为97.12%、95.58%、78.49%(表3),多物种比对一致性可高达91.76%(图3),说明Akt基因氨基酸序列在物种间高度保守。采用邻接法构建系统发育树发现,伸展摇蚊与同属于双翅目的埃及伊蚊、铜绿蝇、致倦库蚊、黑腹果蝇等昆虫最为接近,其中同源关系较近的为埃及伊蚊,与鞘翅目的马铃薯甲虫、光肩星天牛以及鳞翅目的家蚕、棉铃虫关系较远(图4)。

与伸展摇蚊FoxO编码的氨基酸序列一致性最高的为岸溪摇蚊的98.66%,与范氏多足摇蚊的一致性可达90.48%,与致倦库蚊的一致性为60.94%(表3),多物种比对一致性为81.60%(图3),说明FoxO基因编码的蛋白高度保守。采用邻接法构建系统发育树发现,伸展摇蚊与埃及伊蚊、淡色库蚊等双翅目长角亚目昆虫聚为同一分支,并与双翅目短角亚目的黑腹果蝇、桔小实蝇亲缘关系最近。与Pdk、Akt不同的是,FoxO与鳞翅目的家蚕、梨小食心虫的亲缘关系要比光肩星天牛、米象等鞘翅目昆虫更为接近(图4)。

2.4 基因时序表达分析

InR、Pdk、Akt、FoxO基因在伸展摇蚊不同发育阶段的表达量结果(图5)显示,4种基因的表达水平趋势基本相同,均在Ⅰ龄表达量最高。在幼虫经历一次蜕皮,进入到Ⅱ龄后,各基因表达量迅速下降至一个谷值,仅为Ⅰ龄期的4%、44%、10%、13%。在Ⅱ龄到Ⅳ龄幼虫阶段,表达量随着龄期的增长呈现出持续增长状态,发育到蛹期后又有所下降。与蛹期相比,羽化后的雌性成虫各基因的表达量又有所升高,可达蛹期的1.8～3.3倍;而雄性成虫各基因的表达量呈现出持续下降趋势,仅为蛹期的30%～50%。雌性成虫的InR、Pdk、Akt、FoxO基因表达量均显著高于雄性成虫,分别为雄性成虫的6.5、4.7、7.0、6.5倍(图5)。

L1～L4分别表示Ⅰ～Ⅳ龄幼虫;Pu—蛹期;FA—雌性成虫;MA—雄性成虫。

3 讨论

胰岛素信号通路一方面可以根据外部环境条件变化调节昆虫物质和能量代谢,直接调控昆虫生长发育,另一方面还能通过影响保幼激素、蜕皮激素的合成来改变昆虫发育进程,影响发育和繁殖过程[32]。胰岛素信号通路是研究外源性化合物对无脊椎动物内分泌干扰作用机理的重要途径。伸展摇蚊作为生态毒理学研究的模式生物,其胰岛素信号通路上游基因InR、Pdk、Akt、FoxO序列的鉴定对进一步研究其在内分泌干扰性中的作用具有重要意义,相关氨基酸序列结构及其进化保守性可为筛选基于胰岛素信号通路的无脊椎动物内分泌干扰性基因标志物提供关键信息[15]。与埃及伊蚊、黑腹果蝇、家蚕等其他模式生物相比,伸展摇蚊InR蛋白氨基酸序列仅缺少了1个含45～48个氨基酸FU保守结构域,而Pdk、Akt、FoxO蛋白的氨基酸序列的保守结构域则完全一致[33]。结合多物种比对及系统发育树分析结果,伸展摇蚊InR、Pdk、Akt、FoxO等胰岛素信号通路上游基因与其他昆虫同源性较高,具有较高的进化保守性,可以作为研究无脊椎动物内分泌干扰性的潜在基因标志物。

昆虫发育过程中,激素水平的周期性变化通过一系列基因调控蜕皮、变态、求偶、繁殖等行为,且这种调控具有时间特异性。研究发现,家蚕成虫注射胰岛素样神经肽家蚕素后,血淋巴中海藻糖和脂质水平并不会像在幼虫中一样显著降低[34-35]。因此,确定激素调控基因在不同发育阶段的背景表达情况是研究外源性化合物内分泌干扰作用的基础。在伸展摇蚊中,胰岛素信号调控基因InR、Pdk、Akt、FoxO在不同发育阶段均有表达,且表达量趋势基本相同,在Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫时期出现了2个峰值。鉴于胰岛素信号主要决定昆虫生长速率[32],推测伸展摇蚊Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫生长最快。Ⅰ龄幼虫是卵孵化后最初的幼虫形态,4个胰岛素信号调控基因的高表达提示此阶段是幼虫各组织、器官生长的关键时期。与伸展摇蚊类似,在对美洲白蛾(Hyphantriacunea)的研究中,InR、Akt、FoxO、PI3K、mTOR等胰岛素信号通路在Ⅰ龄幼虫阶段亦显示出较高的表达量[27],FoxO在桔小实蝇的幼虫刚孵化时表达量最高[36]。Ⅳ龄为伸展摇蚊的幼虫末龄,4个胰岛素信号调控基因在此时均出现表达峰值,表明此时幼虫生长加速,为获得关键体重、启动蛹化变态做准备。这与烟草天蛾(Manducasexta)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)等昆虫体重主要在末龄幼虫获得的规律一致[28,37]。

InR、Pdk、Akt、FoxO的表达量在伸展摇蚊中表现出了性别差异性,4种基因在雌性成虫中的表达量均显著高于雄性成虫,分别达雄性成虫的6.5、4.7、7.0、6.5倍,这种雌雄表达水平的差异在家蚕、桔小实蝇等昆虫中也同样被观察到[33,38]。大量研究表明,胰岛素信号通路会参与调节昆虫卵巢细胞的发育。敲低InR基因后,鳞翅目二化螟(Chilosuppressalis)的卵母细胞无法发育成熟,卵黄原蛋白的生成受阻,卵巢内卵黄沉积减少[39];而对赤拟谷盗等多种昆虫的InR基因进行RNA干扰后,均出现了明显的繁殖力下降现象[25,37]。对豆荚野螟注射InR、Akt、FoxO基因的特异性双链RNA,均可显著降低对应基因mRNA水平,并干扰卵巢正常发育[40]。FoxO蛋白可以介导营养信号对卵母细胞生成的调节,在营养缺乏的条件下进入细胞核,抑制卵母细胞的增殖[41],还可直接与卵黄原蛋白基因启动子中的FoxO应答元件结合,从而影响卵黄的发生与成熟[42]。因此,InR、Pdk、Akt、FoxO基因在伸展摇蚊雌性成虫中的高表达可能与其参与卵巢组织的发育成熟及卵黄原蛋白的合成与沉积有关。

4 结论

(1)该研究获得了伸展摇蚊胰岛素信号通路基因(InR、Pdk、Akt、FoxO)全长和ORF序列信息,推导出分别编码了1 436、470、520、522个氨基酸序列的蛋白,对推导出的氨基酸序列进行了多种生物信息学分析,并通过近缘物种序列比对以及系统发育树构建,验证了胰岛素信号通路基因在昆虫的进化过程中的保守性,为深入研究伸展摇蚊胰岛素信号通路基因提供了理论基础。

(2)该研究明确了胰岛素信号通路基因在伸展摇蚊Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄、Ⅳ龄幼虫,蛹,雌性成虫,雄性成虫等不同发育阶段的表达模式。结果表明,InR、Pdk、Akt、FoxO均在生长速度最快的Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫阶段表达量最高,且在雌性成虫体内的表达量显著高于雄性成虫,说明胰岛素信号通路在伸展摇蚊的生长发育和繁殖方面发挥了重要作用。