糖基化在糖尿病性白内障发病中的作用研究进展△

陈易寻 罗家伟 朱 俭 孟 艳 季 敏 管怀进

白内障为眼科常见疾病,是眼病患者主要的致盲原因之一。晶状体混浊是其突出的临床特征,常导致患者视力损害和失明。2012年据世界卫生组织统计,白内障是仅次于屈光不正(43%)的第二大视力损害眼病(33%)[1]。糖尿病是一种严重危害人类健康的内分泌代谢性疾病,其发病率在全球范围内呈上升趋势,据国际糖尿病联合会预测,到2030年全球将有4.39亿糖尿病患者[2]。糖尿病发病率的增加也使得糖尿病性白内障的发生率同样上升,作为糖尿病常见的眼部并发症,糖尿病性白内障已成为人们视力损害的重要因素[3]。研究表明,糖尿病患者白内障的发生率较正常人高2～5倍,其发病率还会随着糖尿病病程的发展而显著增加,且糖尿病性白内障的病理改变较年龄相关性白内障出现得更早且更严重。因此,明确糖尿病性白内障病理过程中关键的分子生物学机制,寻求早期发现及早期干预的最新手段,切实提高患者的生活质量,具有极大的临床与社会价值[4]。

目前人们认为,糖尿病性白内障的发病是一个多因素参与的过程,涉及其中的机制包括多元醇代谢异常/渗透失衡、氧化应激损伤以及蛋白质糖基化等。不同的机制均会引起晶状体相关蛋白表达、修饰以及蛋白间相互作用的改变。糖基化是用糖类修饰生物分子的过程,蛋白质糖基化是一种对蛋白质功能和折叠至关重要的翻译后修饰,因为聚糖的附着改变了多肽的生物物理性质。糖基化是一个极其复杂的调控过程,由于糖基化常发生在内质网和高尔基体内,核苷酸糖前体的可用性、糖基转移酶水平和这些细胞器的活性共同参与了蛋白质糖基化的发生和发展。因此,了解糖基化的过程对糖尿病性白内障生物标志物的发现以及新的治疗方法的挖掘至关重要。狭义上的糖基化指的是一个酶调节的过程,即糖分子在酶促作用下通过不同的化学连接结合到蛋白质的氨基酸残基形成糖苷键。广义上的糖基化则包含了酶促糖基化及非酶糖基化。非酶糖基化又称为糖化,是无需酶催化的条件下,蛋白质和葡萄糖之间自发形成糖基化蛋白质的过程[5]。本文就糖基化参与糖尿病性白内障发病的机制及其干预方法进行综述,希望为糖尿病性白内障的预防和治疗提供参考。

1 酶促糖基化对晶状体蛋白质的影响

酶促糖基化主要可分为以下3种类型,分别是N-糖基化、O-糖基化与O-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)糖基化,其中又以N-糖基化和O-糖基化这两种糖基化机制研究得较为深入。N-糖基化过程总是含有一个由两个N-GlcNAc残基和三个甘露糖残基组成的五糖核心,而在O-糖基化中,聚糖可以附着在丝氨酸或苏氨酸残基上。O-GlcNAc糖基化过程是一种比其他聚糖类型更动态的修饰,因为它可以被O-GlcNAcase 酶可逆地去除。在O-GlcNAc糖基化过程中,单个GlcNAc单糖通过O-GlcNAc转移酶的β-连锁连接到靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上。与此同时,GlcNAc也可以通过O-GlcNAcase酶的活性从蛋白质中去除,使其成为比其他聚糖更短暂的修饰[6]。

以上3种糖基化类型均能通过调节蛋白在细胞中的定位、蛋白稳定性以及蛋白-蛋白相互作用来改变靶蛋白功能。在2型糖尿病患者的前囊膜中,除了膜和细胞质标记外,还存在具有高刀豆蛋白A标记的核周小泡。抗泛细胞角蛋白抗体的免疫组织化学检测结果显示与刀豆蛋白A共定位且与刀豆蛋白酶A共定位的凝集素印迹在约65 000处显示出电泳条带,其分子量大小与人类1型细胞角蛋白相对应。这些结果均提示N-糖苷键连接的人1型细胞角蛋白的过度表达可能导致囊膜中断,中断的囊膜的选择性通透能力下降,从而不同分子量的蛋白有机会进入晶状体,促进了白内障的发生与发展[7]。

此外,蛋白质糖基化不足也会引起眼部病变,如先天性糖基化障碍(CDG)是一组遗传性多系统疾病。I型CDG患者体内脂链寡糖的组装存在缺陷或被转移到新生糖蛋白上,从而导致患者生理状态下的糖基化修饰缺陷。约70%的Ia型CDG患者存在眼部异常,包括白内障[8]。

2 非酶糖基化对晶状体蛋白质的影响

蛋白质的非酶糖基化是一系列复杂的非酶促反应过程,蛋白质中存在的ε-氨基(精氨酸或赖氨酸)和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱和Amadori等早期糖基化产物,再通过氧化、重排、交联等反应生成不可逆的非酶糖基化终末产物(AGE)[9]。

高糖状态下,AGE将积累于再生能力低、氧化应激严重的组织,如眼球中。由于AGE具有广泛且重要的生物学作用,其对糖尿病性白内障的影响已成为近年来研究的热点。目前研究认为,AGE主要通过以下几种方式对晶状体造成损伤:(1)使非酶糖基化修饰的蛋白发生交联;(2)与细胞表面AGE受体结合,干扰细胞信号转导途径;(3)促进活性氧的过度产生,经糖基化造成氧化应激破坏组织;(4)诱导核内DNA突变累积。

2.1 以交联为手段直接改变蛋白质功能

晶状体中的蛋白质寿命极长,且几乎没有更新周转,这为表观遗传修饰后蛋白质的积累提供了可能。同时AGE对蛋白质的修饰,可显著抑制酶的活性[10]。在蛋白质发生糖基化后,即便患者良好地控制了血糖,蛋白质之间或蛋白质与糖基化诱导剂之间仍可以通过聚合作用形成更大的分子,从而引起正常生理结构的破坏[11]。除上述糖基化对结构蛋白的改变外,AGE还促进了许多重要的细胞外基质的增生和交联。Hong等[12]发现,AGE可诱导纤连蛋白、I 型胶原蛋白的 mRNA 和蛋白质表达。Twigg等[13]还发现AGE可上调结缔组织生长因子和胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白2的表达,它们是细胞外基质合成和血管生成的有效诱导剂。这些发现表明 AGE可能会诱导与晶状体上皮细胞纤维化相关的 mRNA 和蛋白质的表达,从而引起糖尿病性白内障的发生与发展。

2.2 改变多种细胞信号转导途径

晚期糖基化终末产物受体(RAGE)免疫球蛋白家族跨膜蛋白是细胞外AGE以及其他种类蛋白质和分子的主要受体。AGE-RAGE系统导致至少三种主要信号通路的激活:Ras/MAPK/NF-κB、JAK/STAT和Rac1/CdC42。这些信号转导途径又通过NADPH氧化酶启动活性氧的产生,并导致促炎细胞因子(如IL-6、TNF-α)、促血管生成因子(如VEGF-A、VCAM1)以及RAGE自身的表达增加[14]。

同时糖尿病性白内障的进展还涉及上皮-间质转化(EMT),EMT可能在上皮细胞纤维化中发挥作用,并参与晶状体后囊膜混浊的病理过程。细胞外基质-AGE通过激活 AKT/Snail 通路增强了 TGF-β2 介导的EMT反应,其中αB-晶状体蛋白作为TGF-β2和AGE介导的信号通路之间的接头发挥重要作用[15]。在人类晶状体上皮细胞中,AGE-RAGE相互作用也可以启动促炎信号级联反应,导致RAGE上调和NF-κB活化,进而诱导TGF-β的合成和TGF-β2介导的EMT[16]。

所以调控AGE-RAGE系统将成为开发新型临床药物可选择的有效靶点。已有研究表明,槲皮素可通过抑制 TGF-β2/PI3K/Akt 的激活发挥增强细胞抗氧化能力、抑制醛糖还原酶AR活性和减少AGE产生的作用,有效改善高糖诱导的SRA01/04细胞的EMT[17]。Wu等[18]研究发现,3H-1,2-Dithiole-3-Thione(D3T) 能够通过激活AMPK信号通路及消除 AKR1B1 诱导的糖尿病氧化应激,保护晶状体上皮细胞免受果糖诱导的EMT。

2.3 促进晶状体蛋白质的氧化

超氧化物歧化酶是晶状体中主要的抗氧化酶,可通过将超氧化物自由基(O2-) 转化为过氧化氢和氧气起到抗氧化的作用。在糖尿病模型中人们发现,超氧化物歧化酶能够保护晶状体对抗白内障的发展[19]。因此抗氧化酶及还原物质活性降低是白内障发生的风险因素之一。糖基化介导的抗氧化酶失活可能导致细胞内抗氧化防御机制的紊乱,进而引发细胞内的促氧化状态并最终引起与糖尿病长期并发症相关的各种病理变化[20]。与正常人晶状体相比,糖尿病患者的晶状体更容易受到氧化应激的影响。糖基化诱导的蛋白质构象改变将使得未暴露的巯基被氧化,在糖尿病患者的晶状体中,多元醇途径的活性增加可能与糖基化过程协同作用共同导致二硫键的加速形成,最终引起还原型谷胱甘肽GSH水平降低[21]。还原型谷胱甘肽的减少则导致了晶状体的氧化还原失衡。

对氧磷酶(PON)是一种具有芳基酯酶和硫乳糖酶活性的抗氧化酶, PON1和PON2在所有眼组织中均有表达,在眼球中起到了抗氧化的作用。生物信息学研究和体内外实验表明,AGE可能会降低PON芳基酯酶和PON硫乳糖酶活性,导致白内障晶状体的PON硫乳糖酶活性被显著抑制,引发组织氧化还原失衡[22]。

各类抗氧化酶通常作为一个整体发挥作用,保护过氧化氢酶和过氧化物酶免受O2-的抑制,而过氧化氢酶和过氧化物酶保护超氧化物歧化酶免受过氧化氢的失活作用。如果抗氧化酶本身被糖基化诱导的氧化应激破坏,则会大大加剧氧化应激带来的损害。

2.4 核内DNA突变累积

据报道,3-磷酸甘油醛和赖氨酸反应生成的糖基化产物至少会对DNA造成三种不同的损伤:修饰的DNA碱基、无嘌呤/无嘧啶位点和链断裂。其中,无嘌呤/无嘧啶位点具有潜在的致突变性[23]。

3 非酶糖基化对主要晶状体蛋白质的作用

晶状体结构蛋白占总可溶性晶状体蛋白的80%～90%,分为3种基本类型,分别是α-晶状体蛋白、β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白。晶状体蛋白紧密堆积的空间排列顺序对维持晶状体的透明性和稳定性至关重要。通过高效液相色谱HPLC分离糖化晶状体蛋白,发现晶状体蛋白糖化速率的排序为:α-晶状体蛋白>β-晶状体蛋白>γ-晶状体蛋白[24]。

3.1 α-晶状体蛋白

α-晶状体蛋白是最主要的结构蛋白,由αA和αB两个亚基构成,其在晶状体内的占比可达到总蛋白的50%,被认为是维持晶状体透明度的关键结构及功能单位,它的伴侣功能可以与部分未折叠的蛋白质相互作用以阻止聚集,保护其他蛋白质免受热聚集,同时这也有利于防止光散射聚集体的形成,保持眼睛晶状体的透明度[25]。由于晶状体蛋白质在生物体的整个生命周期中会经历各种蛋白质修饰,这使其高度易变和易聚集,因此这一作用对于防治白内障至关重要[26]。对人晶状体α-晶状体蛋白的分析结果显示,与年龄匹配的对照组相比,所有糖尿病患者晶状体中的伴侣活性都较低。在半乳糖血症大鼠晶状体中同样发现α-晶状体蛋白伴侣活性受损。体外研究表明甲基乙二醛(一种糖酵解和氧化应激途径的中间产物)也会对人类α-晶状体蛋白产生影响,暴露于甲基乙二醛会导致蛋白质结构的展开、疏水裂缝的破坏、热稳定性和热力学稳定性的降低以及蛋白质伴侣活性的丧失[27]。

3.2 β-晶状体蛋白

针对晶状体中的糖基化β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白及其循环自身抗体(IgG),Ranjan等[28]开发了一种非竞争性酶免疫分析法,检测链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血清,发现糖尿病大鼠晶状体在第8周末时,抗γ-糖化晶状体蛋白抗体的浓度比β-糖化晶状体蛋白抗体的浓度高1.2倍。

3.3 γ-晶状体蛋白

晶状体核中含有丰富的可溶性γ-晶状体蛋白,其稳定的构象可以承受压力。但γ-晶状体蛋白的糖基化可以导致其伴侣活性丧失,使得蛋白质更容易被修饰,进而导致蛋白质聚集和或共价交联,最终引起白内障[29]。对人γB-晶状体蛋白糖基化倾向的理论研究表明,葡萄糖优先与Gly1或Lys2结合[30]。体外由核糖、半乳糖、甲基乙二醛和甘油醛诱导的γB-晶状体蛋白主要通过Lys-Arg和Lys-Lys残基之间的交联在N端糖基化α-氨基[31]。

4 结束语

目前人们对于糖尿病性白内障的发病机制仍未完全清楚。在糖尿病性白内障中,糖基化修饰对晶状体中各种蛋白质及酶的影响与糖尿病性白内障的发生与发展有着千丝万缕的联系。因此,明确糖基化过程对揭示糖尿病性白内障病理进展的分子生物学机制以及有针对性地开发新型药物尤为重要,具有很大的临床意义。