METTL基因家族在眼科疾病中的作用及研究进展△

王 晶 谭 耀 李德爽 黄建国 杨智茹 谷 浩 秦 波

1 METTL基因家族的研究概况

甲基转移酶样蛋白(METTL)家族是由7条β折叠链甲基转移酶组成的亚家族,其顺序为β3β2β1β4β5β7β6[1]。METTL家族的成员具有一个保守的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合结构域,该结构域不仅能够甲基化蛋白质,还可以甲基化核苷酸和其他小分子代谢产物[2]。如今在脊椎动物中发现METTL家族有33个成员,其中12种能够修饰DNA或RNA核苷,15种能够修饰蛋白质残基,还有6种功能目前未知[3]。METTL蛋白具有广泛的底物范围,涉及广泛的细胞生物学过程,包括肿瘤发生、心血管疾病[4]和病毒复制[5]。其在癌症进展中也发挥着一定功能,17个METTL基因家族成员已经先后被证实具有癌基因或抑癌基因的作用。目前,已发现METTL3、METTL5、METTL14、METTL23参与眼科疾病发生,而其他METTL家族成员目前还未有关于眼病的深入研究,当其甲基化调节发生异常时,可能导致多种疾病的发生发展。

2 METTL基因家族介导的甲基化调控机制的研究进展

2.1 METTL3 蛋白

METTL3蛋白作为目前研究最广泛的METTL家族成员,是甲基转移酶中的一种高度保守蛋白,具有SAM结合活性,最初被称为MT-A70,MT-A70属于mRNA,是m6A甲基转移酶与SAM的结合亚基。METTL3蛋白通常存在于富含前体mRNA剪接因子的核斑点上[6]。这使得m6A阅读器蛋白能够通过METTL3蛋白来识别并介导mRNAs的剪接、运输和翻译[7]。当哺乳动物中METTL3基因缺失时,聚腺苷酸RNA中的RNA修饰消失,证实了METTL3基因在聚腺苷酸mRNA中m6A修饰的重要性[8]。此外,METTL3基因在多个位点上被泛素样修饰物1修饰,这在调节RNA m6A甲基转移酶的活性中起关键作用[6]。同时METTL3基因是甲基转移酶的核心催化亚基,已证明在精子发生、树突状干细胞激活、造血干细胞分化、膀胱癌进展中起关键作用[9]。单细胞RNA测序发现METTL3基因对于晚期视网膜的生成进展及成熟视网膜的结构和生理稳态至关重要[10],这突出了其甲基化修饰的重要性。

2.2 METTL14蛋白

METTL14蛋白是METTL3/14核心复合体的一部分,由于缺乏SAM结合域,因此纯化的分子无法表现出甲基转移酶活性。它的主要功能是作为RNA结合平台,与底物RNA结合并相互作用,从而增强METTL3蛋白酶的活性,去介导哺乳动物核RNA上的底物识别和RNA m6A甲基化[11]。此外,METTL14蛋白还能直接识别并结合组蛋白H3赖氨酸36三甲基化,并在转录延伸过程中直接甲基化新生RNA,该研究表明m6A RNA修饰和组蛋白修饰之间的相互作用对基因表达有显著影响[12]。尽管METTL14蛋白缺乏SAM导致活性降低,但其却仍能与其他蛋白相结合而发挥一定的作用来维持细胞代谢的稳定。

2.3 METTL1蛋白

METTL1蛋白是一种甲基转移酶,负责促进tRNA、mRNA、微小核糖核酸和核糖体(rRNA)上7-甲基鸟嘌呤-3磷酸核苷(M7G)的翻译和定位[13-15]。在翻译过程中,tRNA作为连接分子,在rRNA特定位置上将氨基酸与相应的mRNA序列连接起来。当破坏rRNA甲基化转录及其他修饰后,通常会导致疾病的发生[16]。其中M7G是这些修饰中最常见的一种,并在修饰部位引入正电荷。因METTL1蛋白形成带有WD重复结构域4的异源二聚体,故M7G甲基化需要METTL1蛋白与WD重复结构域4共同参与。虽然失去芽殖酵母METTL1蛋白的同源物Trm8p亚基具有适度的表型[17],但人类的同源物与双链DNA修复有关,并被证明在膀胱癌、肝细胞癌、急性髓系白血病和肝内胆管癌中起癌基因作用,在结肠癌中起肿瘤抑制作用[18]。当机体缺乏METLL1基因时,细胞翻译将不能正常进行,从而影响甲基转移酶的翻译和定位,最终导致机体产生同源物,其在疾病中扮演癌基因或抑癌基因的作用。

2.4 METTL5蛋白

METTL5蛋白被证实为rRNA甲基转移酶,在真核生物的18S rRNA亚基上被m6A1832标记[19]。与其他METTL基因家族成员一样,METTL5基因为了其功能的稳定性,需要一个稳定的辅助因子甲基转移酶样结合蛋白TRM112,到目前为止,18S亚基上的m6A1832位点是METTL5基因唯一已确定的底物[19],该标记的中断可能会影响许多蛋白质的下游翻译。具体来说,18S rRNA上m6A1832位点的修饰导致rRNA解码中心的构象变化,有利于增加RNA结合,而METTL5蛋白的丢失减少了rRNA的数量,METTL5基因被证实具有促进肿瘤生长和诱导多能干细胞多能性的功能[20]。METTL5基因缺失还会促进心肌细胞肥大[21]、细胞凋亡和错配修复[22]。在胰腺癌细胞中METTL5基因作为促进细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤发生的癌基因,其致癌功能可能涉及c-Myc原癌基因,从而导致c-Myc原癌基因翻译的增加。研究结果表明METTL5基因过表达引起的致癌作用可以通过c-Myc基因敲低消除[23]。缺失METTL5基因将导致整体翻译率降低,多能性自发丧失和分化潜力受损。因此,作为真核生物18S核糖亚基m6A1832的标记酶,METTL5基因的缺失将导致rRNA构象的变化,从而影响rRNA数量,最终可能导致疾病的进展。

2.5 METTL23蛋白

METTL23蛋白作为基因编码的蛋白质,在目前发现的转录途径中充当转录调节因子,它是GA结合蛋白转录因子α亚基的伴侣,并且是一个蛋白质编码基因。METTL23蛋白的一个重要旁系是重组人血管酪肽包含蛋白赖氨酸甲基转移酶,它在精氨酸酶17处二甲基化组蛋白H3多克隆抗体,形成不对称的二甲基精氨酸[24],从而促进染色质重塑,达到激活转录的目的。此外,METTL23基因还促进二甲基化组蛋白H3变体在雄性原核中的结合,进而导致DNA去甲基化酶募集和DNA去甲基化,该基因的突变会导致轻度常染色体隐性智力障碍[25]。有研究发现,METTL23基因是一种在小鼠和猕猴视网膜神经节细胞(RGC)中表达的组蛋白精氨酸甲基转移酶[26]。

3 METTL和眼部相关疾病

目前METTL蛋白在各种疾病中的生物学功能受到广泛关注,早期研究主要集中在心血管和肿瘤方面。然而,近年来越来越多的研究人员开始关注METTL动态调控在眼部相关疾病中的作用,并发现METTL蛋白甲基化修饰参与多种眼部相关疾病的发生发展。

3.1 METTL与角膜病

近年来,由于过度使用皮质类固醇和抗生素,真菌性角膜炎(FK)的发病率持续增加。FK是由机会性致病真菌引起的传染性眼病,可导致严重的视力障碍甚至失明[27]。相关研究表明,在茄碱镰刀菌感染角膜炎小鼠模型中,m6A修饰改变在FK中具有潜在作用,通过免疫染色和Western blot测定METTL3蛋白的表达水平,已证明m6A参与角膜组织的修饰[28]。真菌感染角膜后,甲基化酶METTL3蛋白水平显著升高,m6A对1 137个mRNA进行修饰,其中780个高甲基化,357个低甲基化,同时磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)磷酸化表达增加,这提示m6A修饰可能通过PI3K-Akt信号通路参与FK;角膜新生血管的形成是慢性角膜炎致盲的原因之一,与正常角膜相比,角膜新生血管患者的角膜中不仅m6A的表达上调,同样m6A的去甲基化酶FTO、METTL3蛋白和METTL14蛋白的表达也升高[27]。

3.2 METTL蛋白与白内障

随着全球人口老龄化的快速增长,白内障的发病率逐年升高。目前已成为全球视力损害和致盲的主要疾病之一。Li等[29]通过全基因组谱分析,发现保留m6A修饰的环形RNA分子表达水平低于对照组,而重组人ALKBH5蛋白和METTL14蛋白的mRNA表达水平高于对照组,从而验证了重组人ALKBH5蛋白和METTL14蛋白可能参与了m6A环形RNA分子表达降低的过程。Wen等[30]对高度近视的核性白内障晶状体前囊内的m6A位点利用RNA m6A甲基化测序进行检测,结果提示m6A主要富集在3’UTR、编码序列起始和终止密码子附近;实时荧光定量核酸扩增检测系统结果显示,METTL14蛋白表达上调,METTL3蛋白、重组人ALKBH5蛋白表达下调,通过进一步催化几丁质酶3样蛋白1甲基化,调控细胞外基质炎症标志物甲壳质酶蛋白40的表达水平,促进高度近视病理过程所导致的并发性白内障的发展。糖尿病性白内障也与异常的m6A修饰有关,METTL3蛋白在糖尿病性白内障人晶状体上皮细胞中表达上调,METTL3蛋白以细胞黏附因子-1的3’UTR为靶向稳定其蛋白质表达,从而介导人晶状体上皮细胞的凋亡[31]。因此,METTL3蛋白及METTL14蛋白可能动态调控白内障的发生和进展过程。

3.3 METTL与青光眼

青光眼是一种累及眼前段和后段的退行性疾病,其特征是视盘凹陷增大、RGC死亡,导致视神经萎缩和正常眼压下的视野丧失[32]。目前尚不清楚正常眼压性青光眼(NTG)的发病机制。日本NTG家族中研究发现,其第三代基因中METTL23基因的外显子2中存在单个核苷酸突变,这种突变导致METTL23 mRNA异常剪接,从而改变了亚细胞定位并消除了正常的蛋白质产生[26]。而METTL23蛋白是一种在RGC中表达的组蛋白精氨酸甲基转移酶,其在青光眼的病理生理中起重要作用。具体而言,METTL23蛋白催化了RGC 中组蛋白H3R17的二甲基化,共激活剂相关的精氨酸甲基转移酶1通过增加体外重组多克隆抗体H3R17me2a标记从而正向调节雌激素受体α靶基因转录,并抑制促炎细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)]的核因子κB 激活表达,从而防止RCG发生神经退行性改变[33]。METTL23基因的缺失会增加小鼠视网膜中的TNF-α和IL-1β转录,导致RGC的死亡。这些研究结果表明,METTL23基因在NTG中具有组织特异性病理学作用,其中核因子κB介导的TNF-α和IL-1β的负调节对维持RGC的稳态至关重要。以上的研究结果为我们提供了有关METTL23蛋白在青光眼病理生理中作用的重要线索。

3.4 METTL与玻璃体视网膜疾病

视网膜缺血、缺氧引起的新生血管是多种视网膜血管疾病的常见病变,如早产儿视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性等,也是导致视力损害的主要原因之一。研究表明,在小鼠缺氧致视网膜病变模型中,m6A甲基化水平明显上调[34]。因此m6A甲基转移酶METTL3蛋白是调控缺氧诱导的视网膜新生血管的关键酶之一[34]。具体来说,METTL3蛋白通过YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1依赖的方式促进Wnt信号通路成员低密度脂蛋白受体相关蛋白6和人源重组蛋白P01的翻译[35]。而Wnt信号通路高度保守,参与调节视网膜发育、视网膜新生血管和视网膜色素上皮(RPE)细胞的迁移。在增生性玻璃体视网膜病变细胞系中,METTL3蛋白的表达下调,从而通过增加Wnt信号通路的下游基因MMP9的表达,增强RPE细胞的增殖和迁移,促进了增生性玻璃体视网膜病变的发生和发展[36]。一项研究表明,敲除METTL3基因后,加强了高糖环境对RPE细胞的毒性作用,使糖尿病视网膜病变加速进展,而过表达METTL3蛋白则能通过微处理蛋白DGCR8上调miR-25-3p/PTEN(一种新发现的肿瘤抑制基因)轴,使其磷酸化Akt水平升高,从而减少高糖环境对RPE细胞的毒性作用,证实m6A 修饰可参与糖尿病视网膜病变诱导的 RPE 损伤[37]。此外,当视杆细胞中METTL14基因丢失,会导致暗反应减弱和视杆细胞变性。在机制上,转录组学分析与RNA m6A甲基化测序相结合表明,METTL14蛋白失活导致m6A耗竭,从而导致多个光转导和纤毛相关基因的表达水平降低,随后导致纤毛生成受损,并损害视杆细胞中外段驻留蛋白的合成和转运,致使内段中集聚多种外段蛋白,而METTL14蛋白的耗竭导致甲基转移酶复合物METTL3/WTAP水平急剧降低,进而导致m6A 甲基化水平降低[38]。总的来说,缺氧应激可以诱导人脐静脉内皮细胞和小鼠视网膜中m6A修饰和METTL3蛋白水平升高。敲低或敲除METTL3基因可以抑制氧化应激所导致的人脐静脉内皮细胞血管生成以及角膜和视网膜的病理性血管生成。其致病机理是通过依赖YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1的方式使节段极性蛋白1和低密度脂蛋白受体相关蛋白6减少,从而去调节Wnt信号激活来实现的[35]。METTL14蛋白在调节光转导和纤毛生成过程中,通过催化m6A RNA甲基化对光感受器发挥作用,凸显了m6A修饰在视觉功能中的重要性,而m6A修饰是一种动态且可逆的修饰,METTL3/14蛋白形成稳定的异二聚体核心二聚体复合物,而WTAP是一种哺乳动物剪接因子,可以与这种复合物相互作用并影响其甲基化。m6A可被去甲基化酶FTO和重组人ALKBH5蛋白敲低[39]。METTL14基因的缺失会损害视杆光感受器中多种完整的光转导途径蛋白转运,从而导致光感受器功能障碍和视网膜变性。

3.5 METTL基因和眼部肿瘤

目前,METTL基因介导m6A修饰在癌症中的作用和机制研究是肿瘤生物学的热点之一,在眼部肿瘤研究中,已有研究发现m6A修饰与眼部肿瘤疾病有关[40]。眼黑色素瘤(OM)是成人最常见的原发性恶性肿瘤,包括葡萄膜黑色素瘤(UM)和结膜黑色素瘤。研究表明,在OM中,m6A及MTLLE3蛋白表达在OM中表达降低,而m6A去甲基化酶重组人ALKBH5蛋白表达升高;此外,微管相关蛋白(MAP2)与 RPE 细胞中的致病基因神经元分化 1相互作用。METTL14蛋白与MAP2 mRNA相结合,并通过m6A修饰阅读蛋白抑制MAP2表达[41]。而METTL14蛋白缺乏会导致m6A甲基化减弱,最终导致基因表达失调。另一项研究表明,METTL14蛋白还通过降低特定光转导和纤毛相关基因的表达来抑制视网膜光转导和纤毛生成过程[38]。这对于视网膜色素变性类视网膜病变的治疗干预提供了新的见解。

综上所述,m6A修饰在眼部肿瘤和视网膜色素变性中起重要作用,为相关疾病的治疗提供了新的思路。有研究表明,m6A甲基化水平在UM细胞系和临床标本中显著增加,但这与其他研究得出的结论相矛盾。具体来说,上调的METTL3可以通过靶向细胞间质上皮转换因子参与Akt信号通路和细胞周期相关蛋白的调控,从而促进UM的进展[42]。而另有研究认为,m6A修饰增加有利于肿瘤的生长和侵袭。在视网膜母细胞瘤细胞系中,METTL3蛋白高表达可以通过PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白信号通路上调癌基因表达,促进视网膜母细胞瘤细胞增殖[43]。HINT2被证明是OM中的肿瘤抑制基因,而YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1则以m6A依赖性方式促进HINT2 mRNA的翻译[44]。另外,METTL3蛋白介导的m6A也参与了人β位淀粉样前体蛋白裂解酶2的高表达,而人β位淀粉样前体蛋白裂解酶2在眼部黑色素瘤中已被证明起致癌作用[45]。

3.6 METTL和其他眼病

在Graves眼病中也发现METTL3介导m6A修饰的表达,Graves眼病患者血清中WTAP、m6A修饰阅读蛋白和m6A结合蛋白2水平显著上调[46],提示METTL3蛋白介导m6A修饰不仅参与原发性眼病,还参与其他系统继发性眼病的发病,为进一步研究METTL在眼病中的作用开辟了新思路。

4 结束语

本文综述了METTL在眼科疾病的研究进展,介绍了METTL的结构和功能以及在眼部疾病中的潜在作用。METTL16 蛋白是m6A靶向前 mRNA 和各种非编码 RNA 的甲基转移酶[47]。有学者提出可以利用单分子实时和纳米孔直接RNA测序在细胞水平研究m6A修饰[46],这为后续研究m6A修饰METTL家族蛋白提供了新的思路。研究表明,在非小细胞肺癌中,METTL7B 的上调通过调控细胞周期来促进肿瘤的发生和发展,沉默METTL7B基因可以抑制肿瘤的发生和发展,因此METTL7B是一个潜在的治疗靶点[48]。虽然METTL甲基化修饰在肿瘤、神经、心血管疾病中的应用已得到广泛研究,但在眼科疾病中的研究相对较少。此外,有报道称一些靶向m6A修饰酶的小分子激活剂或抑制剂已经存在[49]。其中大多数仍处于临床前阶段。实验发现小分子配体能与METTL3-14-WTAP复合物的活性位点相结合,从而确定小分子配体为METTL3-14-WTAP激活剂[50],未来可能对METTL甲基化参与眼病发挥治疗作用。

本文着重阐述了METTL在角膜病、白内障、青光眼、眼部肿瘤、视网膜疾病等疾病发生中的调控作用,但其是否参与其他眼病的调控仍需进一步研究。一些研究提出METTL修饰可以作为癌症治疗的新靶点,因此METTL修饰也有可能成为治疗眼部相关疾病的新靶点。随着对眼部疾病发病机制和METTL修饰的深入了解,METTL修饰提供了新的视角,有助于指导眼部疾病的诊断和治疗,具有重要的意义。