肝硬化患者血清lncRNA SNHG7表达变化及其与病情严重程度和预后的关系

郭海亮，李德新

1 北京市平谷区医院内科，北京 101200；2 北京市平谷区医院检验科

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，是各种病因长期、反复作用形成的弥漫性肝损害，主要特征为弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成以及正常肝小叶结构严重破坏等［1］。肝硬化是全球范围内的高发病和多发病，严重者可能会出现肝性脑病、肝肾综合征、上消化道大出血、肝癌等并发症，进而威胁患者生命安全［2-3］。目前，肝硬化的发病机制仍不完全清楚。因此，深入探索肝硬化发生、发展相关的生物标志物，对其早期诊断意义重大。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的RNA 分子，虽然不具备蛋白编码功能，但在染色质动力学、基因表达、细胞生长和分化调节中起关键作用［4］。近年研究发现，lncRNA 表达或功能异常与人类多种疾病的发生、发展密切相关［5］。小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）是一种新发现的致癌性lncRNA，全长2 176 bp，定位于人染色体9q34.3。有研究报道，lncRNA SNHG7 在非小细胞肺癌［6］、前列腺癌［7］、结直肠癌［8］、胃癌［9］等恶性肿瘤细胞中异常表达。XIE等［10］研究发现，lncRNA SNHG7还与肝纤维化的发生、发展密切相关。而肝纤维化是肝硬化的前期病变，也是肝硬化发生的病理生理基础。由此推测，lncRNA SNHG7 可能在肝硬化的发生、发展中发挥重要作用，但目前鲜见相关报道。鉴于此，本研究探讨了肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年1月—2021年12月北京市平谷区医院内科收治的肝硬化患者80例（观察组）。纳入标准：①符合肝硬化诊断标准［11］，并经肝穿刺活检证实；②年龄18～80 岁；③临床资料完整；④认知功能正常。排除标准：①合并其他肝脏疾病者；②合并其他部位恶性肿瘤者；③合并凝血功能障碍者；④合并心、肺、肾等重要脏器功能不全者；⑤治疗依从性差者。其中，男44 例、女36 例，年龄（55.12 ± 5.78）岁，BMI（23.12 ± 2.45）kg/m2，有吸烟史48 例、有饮酒史42 例，Child-Pugh 分级［12］：A 级30 例、B 级28 例、C 级22 例。同期另选在北京市平谷区医院体检健康的志愿者80 例（对照组），男42例、女38 例，年龄（56.21 ± 5.98）岁，BMI（23.45 ±3.26）kg/m2，有吸烟史43 例、有饮酒史39 例。两组性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史具有可比性。本研究经北京市平谷区医院伦理委员会批准（审批编号：20220415），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 血清lncRNA SNHG7 表达检测 采用实时荧光定量PCR 技术。观察组入院次日，对照组体检当日，采集空腹肘静脉血5 mL，待血液自然凝固后，3 000 r/min 离心10 min、离心半径15 cm，留取上层血清，-20 ℃冰箱保存。采用TRIzol 法提取血清总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按照One Step RT-PCR Kit 说明，将总RNA 逆转录合成为cDNA。以cDNA 为模板，按SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：lncRNA SNHG7 上游引物5'-TTGCTGGCGTCTCGGTTAAT-3'、下游引物5'-GGAAGTCCATCACAGGCGAA-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'、下游引物5'-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。PCR 反应体系共20 µL：cDNA 模板2 µL，2 × SYBR Green qPCR Master Mix 10 µL，上下游引物各1 µL，ddH2O补足至20 µL；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s共40个循环。PCR 扩增反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算lncRNA SNHG7相对表达量。

1.3 肝硬化预后相关的资料收集分析 肝硬化患者入院后予改善肝功能、抗肝纤维化、防治并发症等规范治疗，肝功能恢复正常，无明显临床症状后出院。出院后通过电话或门诊复查形式定期随访6 个月，预后不良23 例、预后良好57 例。收集肝硬化患者一般资料（包括性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史）以及入院时血清胆红素、肌酐、凝血酶原时间国际标准化比值（INR）、白蛋白（ALB）、凝血酶原时间（PT）和Child-Pugh 评分。比较肝硬化患者预后不良者与预后良好者上述临床资料，将有统计学差异的指标纳入多因素Cox 回归模型，分析肝硬化患者预后不良的危险因素。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料经Kolmogorov-Smirnov 检验符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman 相关分析法。危险因素分析采用多因素Cox 回归模型。预测效能分析采用受试者工作特征（ROC）曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清lncRNA SNHG7 表达比较 观察组与对照组血清lncRNA SNHG7 相对表达量分别为2.16 ± 0.52、1.12 ± 0.22，观察组血清lncRNA SNHG7 相对表达量高于对照组（t=16.475，P＜0.05）。

2.2 不同Child-Pugh 分级肝硬化患者血清lncRNA SNHG7表达比较 Child-Pugh分级A、B、C级肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相对表达量分别为1.75 ±0.44、2.21 ± 0.48、2.65 ± 0.68，Child-Pugh 分级A级肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相对表达量低于Child-Pugh 分级B、C 级肝硬化患者（t分别为3.584、6.025，P均＜0.05），Child-Pugh 分级B 级肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相对表达量低于Child-Pugh 分级C级肝硬化患者（t=2.571，P＜0.05）。

2.3 肝硬化患者血清lncRNA SNHG7表达与Child-Pugh 分级的关系 Spearman 相关分析显示，肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 表达与Child-Pugh 分级呈正相关关系（rs=0.526，P＜0.01）。

2.4 肝硬化患者预后不良的危险因素分析结果 肝硬化患者预后不良者与预后良好者临床资料比较见表1。以肝硬化患者预后（预后不良=1，预后良好=0）为因变量，以胆红素、肌酐、INR、ALB、PT、Child-Pugh评分、lncRNA SNHG7表达为自变量，纳入多因素Cox回归模型。结果显示，Child-Pugh 评分、lncRNA SNHG7 表达为肝硬化患者预后不良的独立危险因素（P均＜0.05），见表2。

表1 肝硬化患者预后不良者与预后良好者临床资料比较

表2 肝硬化患者预后不良的多因素Cox回归分析结果

2.5 血清lncRNA SNHG7 表达对肝硬化患者预后不良的预测价值分析结果 ROC 曲线分析显示，血清lncRNA SNHG7 表达预测肝硬化患者预后不良的曲线下面积为0.895（95%CI：0.821～0.969），其最佳截断值为2.20，此时其预测肝硬化患者预后不良的灵敏度为78.3%、特异度为82.5%、Youden 指数为0.608。见图1。

图1 血清lncRNA SNHG7表达预测肝硬化患者预后不良的ROC曲线

3 讨论

肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段，主要特征为弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成以及正常肝小叶结构严重破坏等［1］。肝硬化早期症状不典型，仅有轻微的厌油、乏力、肝区不适症状；晚期可出现肝功能损害、门静脉高压等相关的症状和体征，并导致多器官受损，严重威胁患者生命安全［13-14］。引起肝硬化的病因有很多，如慢性病毒性肝炎、长期酗酒、胆汁淤积等。目前，肝硬化的发病机制仍不完全清楚。因此，深入探索肝硬化发生、发展相关的生物标志物，对其早期诊断意义重大。

lncRNA 是一类长度超过200 个核苷酸、无蛋白编码功能的RNA 分子，由RNA 聚合酶Ⅱ转录生成。lncRNA 可在表观遗传、转录或转录后、翻译或翻译后水平上调控基因的表达［15］。越来越多研究表明，lncRNA 异常表达与人类多种疾病的发生密切相关，如lncRNA MCM3AP-AS1 在肝细胞癌中高表达，并通过靶向miR-194-5p/FOXA1 信号通路促进肿瘤生长［16］；lncRNA MALAT1在内皮细胞或心肌细胞中过表达，可不同程度参与心血管疾病的病理过程［17］。lncRNA SNHG7 是一种新发现的致癌性lncRNA，全长2 176 bp，定位于人染色体9q34.3。XIE等［18］研究报道，lncRNA SNHG7 在肝外转移的肝细胞癌组织中高表达。YANG等［19］研究发现，lncRNA SNHG7在肝细胞癌细胞中高表达，并且其高表达与患者预后不良呈正相关；下调lncRNA SNHG7 表达则可抑制肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。XIE 等［10］研究发现，lncRNA SNHG7 在肝纤维化小鼠肝组织中表达上调，而敲除lncRNA SNHG7 的小鼠肝纤维化程度有所减轻，表明lncRNA SNHG7 可能是一个候选的抗肝纤维化靶点。而肝纤维化是肝硬化的前期病变，也是肝硬化发生的病理生理基础。由此推测，lncRNA SNHG7 可能在肝硬化的发生、发展中发挥重要作用。

本研究结果发现，观察组血清lncRNA SNHG7相对表达量高于对照组，提示lncRNA SNHG7 可能参与肝硬化的发生、发展。Child-Pugh 分级是对肝硬化患者肝脏储备功能量化评估的分级标准。本研究结果显示，随着Child-Pugh 分级增加，肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相对表达量逐渐升高，并且其表达与Child-Pugh 评分呈正相关，提示lncRNA SNHG7 与肝硬化患者肝功能损伤程度密切相关。进一步研究发现，肝硬化患者预后不良者胆红素、肌酐、INR、PT、Child-Pugh评分及lncRNA SNHG7表达均高于其预后良好者，ALB低于其预后良好者；多因素Cox 回归分析显示，Child-Pugh 评分、lncRNA SNHG7表达是肝硬化患者预后不良的独立危险因素。结果表明，血清lncRNA SNHG7 高表达与肝硬化患者预后不良有关。ROC 曲线分析发现，血清lncRNA SNHG7 表达预测肝硬化患者预后不良的AUC为0.895，其最佳截断值为2.20，此时其预测肝硬化患者预后不良的灵敏度为78.3%、特异度为82.5%。提示lncRNA SNHG7 对肝硬化患者预后不良具有较高的预测效能。

综上所述，肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 高表达，其高表达与病情严重程度增加和预后不良密切相关；lncRNA SNHG7 可作为预测肝硬化患者预后不良的血清生物标志物。但本研究尚存在一定不足之处，如样本量较小、未深入探索lncRNA SNHG7在肝硬化中的具体作用机制，后续将进一步深入研究。