畜禽粪肥源抗生素抗性基因的生态风险评估

赵敏杏,温 馨△,陈 涛,王 军,吴银宝,2,3*

(1.华南农业大学 动物科学学院,广东 广州 510642;2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室,广东 广州 510642; 3. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,广东 茂名525000)

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)作为环境中的新型污染物,兼具“可传播扩散”与“环境持久”的特性,导致微生物抗生素抗性的快速扩散,对全球公共卫生构成重大威胁[1]。研究表明,抗生素的发现和大量使用导致环境中ARGs丰度呈指数型上升趋势,我国畜禽环境中ARGs污染形势十分严峻[2]。谷艳茹等[3]研究发现,施用粪肥会使土壤中sul1、sul2和tetO等 ARGs的相对丰度增加14倍,且还会增加土壤中四环素类、氨基糖苷类、多重耐药类ARGs污染的多样性[4]。由于ARGs会通过垂直转移(vertical gene transfer,VGT)和水平转移(Horizontal Gene Transfer,HGT)的方式在相同种属或不同种属的微生物之间传播,并通过食物链最终影响人类的健康,因而开展ARGs的生态风险评估对于保障人类健康具有重要意义[5]。近年来,科学家对于ARGs的暴露评价已开展了许多研究。但由于存在ARGs过程定量数据匮乏和HGT等问题[6-7],这些研究只关注ARGs的环境暴露污染特征,对其进行生态风险评估鲜有报道,基于畜禽粪肥源ARGs的生态风险评估更为少见。由此,本文总结了环境污染物的生态风险评估框架和评估ARGs生态风险所需的ARGs数据库获取途径及方法,结合畜禽粪肥源ARGs生态风险评估的关键点,提出适用于种养结合模式下畜禽粪肥源ARGs生态风险的评估方法。

1 确定ARGs的生态风险评估方法

1.1 确定ARGs生态风险评估框架

生态风险评估是评价生态系统暴露于一种或多种胁迫因子时不利效应发生的可能性,是在风险管理的框架下发展起来用于制定环境管理决策的主要科学依据[8]。综合各个国家和组织的生态风险评估技术框架和流程,根据欧盟现有风险评价技术指导文件(Technical Guidance Document on Risk Assessment,TGD),结合《中华人民共和国2020生态环境健康风险评估技术指南总纲》和ARGs的污染特征,可综合得出ARGs的生态风险评估框架主要包括暴露评估、危害评估和风险表征这三个阶段。ARGs作为一种新型环境污染物,对其进行生态风险评估时首先需对其进行暴露评估,根据其暴露种类、暴露丰度、暴露时间和暴露地点等特点综合评估不同ARGs的暴露频率和暴露路径,完成暴露评估过程。接着,通过明确目标ARGs的主要危害特性,如微生物抗性、可移动性、宿主致病性和人类相关性等[9-10],通过抗性评估和传播评估的方式综合评价不同ARGs的危害风险值,进而完成危害评估全过程。最后,再根据暴露评估和危害评估的结果采用定量或定性的方法,对目标ARGs在该环境中的生态风险进行风险表征[6-7](图1)。

1.2 确定用于风险评估的数据库及测序工具

对ARGs进行生态风险评估时,首先需要确定评估对象,即确定需要评估哪些ARGs的生态风险。目前,用于确定ARGs基本信息的数据库包括Comprehensive Antibiotic Resistance Database(CARD)[11]和Resfinder等[12],具体作用特点如表1所示。通过检索下述数据库,即可获得目前已知的ARGs的信息。

图1 ARGs的生态风险评估框架Fig.1 Framework of ecological risk assessment of ARGs

表1 ARGs的参考数据库Table 1 Reference database of ARGs

获得ARGs的相关信息后,即可开展目标评估体系中ARGs的检测工作。常用基于PCR的方法和基于基因组测序的方法确定目标评估体系中ARGs的类别。基于PCR的方法,即提取样品微生物DNA,用特定ARGs的引物进行PCR扩增,对目标条带进行测序,从而鉴定ARGs的类别。该方法的优点是比较准确,缺点是效率低。基于基因组测序的方法可借助基因测序工具实现[15],具体如表2所示,可通过对样品微生物 DNA 进行高通量测序或宏基因分析的方法,将获得的基因序列与已知的ARGs数据库(表1)进行比对,即可获得ARGs类别等信息[16]。该类方法成本较高,大多数数据库不够详尽且不是定期更新,但是灵敏度和特异性强,可极大提高ARGs的检出效率。评估基于种养结合模式的畜禽粪肥源ARGs生态风险时,也须采用上述方法确定用于评估的ARGs源数据。

2 ARGs的生态风险评估内容

2.1 暴露评估

暴露评估是畜禽粪肥源ARGs生态风险评估的第一个关键点,即首先要通过畜禽粪肥源ARGs的暴露种类、暴露丰度、暴露时间和暴露地点等,明确其暴露频率和暴露路径。

规模化畜禽养殖场四环素类抗生素在猪粪中的检出率显著高于其它类抗生素[22],由此导致四环素类ARGs在畜禽粪便中的绝对丰度高达1011copies/g,成为畜禽粪肥源主要的ARGs类型[23-24]。不过畜禽粪污通常需经无害化处理后才会进入环境,这就会使其所含ARGs的种类和丰度发生变化[25]。但通过对畜禽粪便采取好氧堆肥、厌氧消化和氧化塘等处理及资源化利用方式也难以有效削减ARGs的丰度[26]。Diehl等[27]发现,tetA和tetX的相对丰度经厌氧消化后增加了30%～150%。Cheng等[28]调查了中国东部8所养殖场经厌氧消化及堆肥处理后粪便中ARGs的丰度,发现10种四环素类抗性基因和2种磺胺类抗性基因在各种畜禽粪便中被广泛检出,ARGs丰度最高达2.26×1011copies/g。Huang等[29]发现,通过氧化塘贮存的粪水中四环素类抗性基因被有效降解了69%～99%,但是tetO、tetM和tetX的相对丰度在不同贮存时期较原始粪便显著上升。

此外,畜禽粪污在进行无害化等处理方式进入到“土壤-植物”系统后,仍会使“土壤-植物”系统中部分畜禽粪肥源ARGs和可移动遗传元件(Mobile Genetic Element,MGEs)的丰度和种类发生变化[30]。以tetX基因为例,会通过施肥的方式,从畜禽粪肥源传播到生菜[31]。研究表明,施用有机肥导致胡萝卜块茎增加了12种ARGs和2个MGEs,ARGs和MGEs的相对丰度均较未施肥前显著上升[32]。但是根际细菌群落稳定性较高,对抗生素的刺激有抵抗作用,对ARGs的传播起到阻遏作用[33]。由于ARGs 无法被降解、稀释等自然过程完全去除,即使微生物裂解死亡后仍有部分ARGs 通过游离态的形式转化到其他微生物体内进行传播扩散[34]。因此,即使停止施用粪肥,环境中的部分ARGs仍会维持在一个较高的水平[35]。

以种养结合模式为例,对畜禽粪肥源ARGs的暴露特征进行综合分析,可初步推断出畜禽粪肥源ARGs在不同暴露路径下的暴露频率,该暴露路径主要包括直接路径和间接路径(图2)。直接路径指养殖场中部分畜禽粪肥源ARGs可通过环境接触和呼吸等途径直接扩散到人体内;间接路径包括5个阶段,“阶段Ⅰ-Ⅴ”指的是不同种类畜禽粪肥源ARGs在“畜禽-粪便-粪肥-土壤-植物-人类”这几个阶段均有检出,表明可能存在部分畜禽粪肥源ARGs通过该途径扩散到人体内,进而对人类健康造成威胁。

图2 种养结合模式下抗生素抗性基因的暴露路径Fig.2 Exposure pathways of antibiotic resistance genes in planting-cultivation combination model

导致ARGs在各个传播路径丰度增加的主次因素很多[36],加之固有方法等因素的限制,解析ARGs在不同传播阶段暴露频率增加的来源及传播趋势仍面临着许多挑战[37]。目前,国内外对于ARGs的溯源已经开展了许多研究。在建立抗生素与ARGs的关联上,Duarte等[38]整合大量文献中抗生素和 ARGs 相关性的数据,使用线性混合模型将ARGs丰度与抗生素压力相关联。在建立其他因素与ARGs的关联上,可采用模型评估方法对ARGs进行溯源分析,量化不同影响因素对评估体系中 ARGs的潜在贡献[39]。

畜禽粪肥源ARGs作为生态风险评估的对象,部分畜禽粪肥源ARGs会通过直接或间接的暴露路径通过污染农作物等方式危害人类健康[40]。因此,建立适用于不同畜禽粪肥源ARGs的暴露评估分析方法,通过筛选出在不同暴露路径下暴露频率较高的畜禽粪肥源ARGs类别,对于构建畜禽粪肥源ARGs生态风险评估框架具有重要意义[41]。

2.2 危害评估

危害评估是畜禽粪肥源ARGs生态风险评估的第二个关键点,在该阶段首先应该明确需要开展危害评估的畜禽粪肥源AGRs的关键危害点,根据不同类别畜禽粪肥源AGRs危害特性的不同,结合抗性评估和传播评估的手段,完成危害评估的过程。

2006年,ARGs被世界卫生组织(WHO)作为下个世纪威胁人类健康的最重大挑战,其主要原因在于携带ARGs的微生物会对抗生素产生耐药性[42]。一项对204个国家所有地区抗生素耐药性影响的数据进行分析的研究表明,抗生素耐药性现在是全球的主要死因,2019年有127万人直接死于抗生素耐药性,495万人的死亡与抗生素耐药性感染有关,目前全球迫切需要解决抗生素耐药性问题[43],而要解决抗生素残留带来的微生物的耐药性问题就需要特别关注微生物抗生素耐药性产生的根源——ARGs[44]。因此,评估畜禽粪肥源ARGs是否会导致微生物产生抗生素耐药性,特别是人类和畜禽常用抗生素的耐药性,是对暴露评估阶段筛选出的畜禽粪肥源ARGs进行危害评估的第一个关键评估点。根据携带不同畜禽粪肥源ARGs的微生物对不同抗生素最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的不同,可把抗生素的类别以及人类常用抗生素的相关程度和重要性等作为划分依据,对不同畜禽粪肥源ARGs的耐药性危害等级做定性的归类和划分。

此外,ARGs还具有“可移动性”,该特性加剧了医用或畜禽用抗生素治疗失败的可能性,同样是对人类和动物健康造成重大威胁的关键危害点。研究表明,ARGs的传播方式包括HGT和VGT。HGT 是指携带 ARGs 的菌株通过接合、转化和传导等方式将遗传物质传递给其他微生物而非其子代的过程[45-46],使其在同种或不同种细菌间进行传播扩散成为可能,较VGT的传播危害性更大[47]。其中,整合子、转座子及质粒等MGEs是HGT的重要载体[48]。系统发育距离、共享生态和基因组约束常被认为是控制HGT的关键因素[49]。因此,通过与数据库进行比对[50-51]等手段对畜禽粪肥源ARGs是否具有潜在“可移动性”进行评估判断,是对暴露评估阶段筛选出的畜禽粪肥源ARGs进行危害评估的第二个关键评估点。

“宿主致病性”是危害评估阶段的第三个关键评估点。“宿主”指的是携带畜禽粪肥源ARGs的潜在宿主和畜禽粪肥源ARGs发生HGT后可能传播到的新宿主,携带或可能通过HGT携带ARGs的微生物是否拥有“致病性”,是临床抗生素治疗失败和“超级细菌”产生的关键因素。在此评估阶段,可通过宏基因组学的方法对ARGs进行源追踪[52],对其存在的宿主是否存在致病性进行评估;或可通过机器学习[53]、微流体技术[54]和荧光标记等[55]方式对畜禽粪肥源ARGs发生HGT的潜在可能性和潜在宿主进行预测。通过判断其潜在宿主和畜禽粪肥源ARGs可能通过HGT传播到的微生物是否是致病菌,以及该致病菌与人类相关性的高低对不同畜禽粪肥源ARGs的危害性进行评估。

微生物抗性、可移动性和宿主致病性是对畜禽粪肥源ARGs进行危害评估的评估关键点,此外,畜禽粪肥源ARGs与人类和畜禽以及各类抗生素使用等的相关性对于危害评估的开展也有重要影响。在此阶段,根据不同类别畜禽粪肥源ARGs的危害特性,理清关键危害评估点的主次顺序,对不同类别畜禽粪肥源ARGs的抗性能力和传播能力进行综合评价,进而完成危害评估过程,对于构建畜禽粪肥源 ARGs生态风险评估框架具有重要作用。

2.3 风险表征

风险表征是生态风险评估的最后一个阶段,需要综合暴露评估和危害评估的结果,通过定量或定性的方式对不同类别畜禽粪肥源ARGs的生态风险进行描述。

在定性表征方面,最为典型的是Ellabaan等[10]构建的ARGs生态风险评估框架,该框架以ARGs作为暴露评估的对象,着重识别具有严重危害公共健康的 ARGs;以“宏基因组学”作为主要的数据分析方法,将“人类相关富集、基因迁移和宿主致病性”作为危害评估的三大要素,最后基于是否符合三大要素及符合哪些要素,将ARGs划分为四个风险等级。具体划分依据如下:三大要素均符合的ARGs被认定为风险等级一;符合要素一和要素二的ARGs被认定为风险等级二;只符合要素一的ARGs被认定为风险等级三;三大要素均不符合的ARGs被认定为风险等级四。

在定量表征方面,最具代表性的是Zhang等[9]提出的风险评估框架,该框架以ARGs作为暴露评估的对象,把“人类可及性、移动性、致病性和临床可用性” 作为危害评估的四大要素。依据ARGs危害评估的要素特征,运用宏基因数据分析的方法,将每个要素的危害评估值量化。其中,“人类可及性”是通过计算AGRs在人类相关栖息地平均丰度和流行率的乘积来进行表示;“移动性”则是通过统计所有完整基因组中检测到ARGs上游和下游5 kb以内的MGEs数量总和来进行表示;“致病性”是通过计算携带ARGs病原体占总宿主的比例来进行表示;“临床可用性”则通过计算ARGs与临床可用抗生素相关的数量总和进行表示。接着,通过计算四个评估要素的乘积,将不同要素的危害评估值归一化,进而得出不同ARGs的人类健康风险指数。最后,依据不同ARGs人类健康风险指数的数值大小,将指数排名前 25%的 ARGs被划为风险等级一级;排名在25%～50% 的ARGs被划为风险等级二级;排名在50%～75% 的ARGs被划为风险等级三级;剩余的则为风险等级四级。由此可见,采用定量评估的方法对ARGs进行风险表征不仅可以将ARGs划分为不同的风险级别,还可比较同一级别不同ARGs风险值的大小和每一个危害要素对人类健康风险指数的影响大小,相较于定性评估而言其获得的结果更为丰富且准确。

综上可知,在对ARGs进行风险表征时,定量评估的方法更优于定性评估,因而在对畜禽粪肥源ARGs进行生态风险评估时,可首先根据畜禽粪肥源ARGs的数据库,采用宏基因组等方法通过对不同暴露特征和路径等进行暴露评估,进而筛选出需进行危害评估的目标ARGs。接着,基于不同种类畜禽粪肥源ARGs的危害特性,明确危害评估关键点对不同类别ARGs的主次效应,将其在单个暴露路径的多个关键点进行综合评估,完成单个暴露路径目标ARGs的危害评估过程。最后,可选用合适的定量或定性评估方法得出ARGs在各个暴露路径的风险总值,根据风险总值的大小划分畜禽粪肥源ARGs的风险等级,以此作为畜禽粪肥源ARGs的生态风险评估模型。

3 小 结

ARGs作为环境中的新型污染物,已对全球公共卫生构成重大威胁。建立畜禽粪肥源ARGs的生态风险评估框架,阐明其在不同暴露路径中的源汇机制和关键危害意义重大。国内外学者围绕畜禽粪肥源中ARGs的主要来源、转移机制及抗生素抗性与微生物群落的互作机制开展了一系列的评估研究,但对于畜禽粪肥源ARGs和微生物功能群落之间的关系、传播途径中的影响因素以及造成的各种人类健康后果仍不明确。如何预测这几个因素在不同暴露路径下对畜禽粪肥源ARGs的影响,以及如何根据畜禽粪肥源ARGs关键危害点选择适用的危害评估方法,提高畜禽粪肥源ARGs风险表征的可信度,仍是畜禽粪肥源ARGs生态风险评估中亟待解决的问题。