呼和浩特市周边地区规模化牛场大肠杆菌K99流行情况调查

刘平平 , 谢梦圆, 李文豪 , 郝彦儒, 王建龙, 王旭红,徐晓静*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院,内蒙古自治区 呼和浩特 010000;2. 内蒙古自治区 动物疫病预防控制中心,内蒙古自治区 呼和浩特 010000)

牛腹泻主要由病原引起,产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)是引起牛腹泻的主要细菌性病原,可导致新生犊牛剧烈腹泻和迅速脱水,造成犊牛生长发育不良,给养牛产业造成巨大经济损失。近些年来,我国由大肠杆菌引起牛腹泻的发病率高达90%,病死率达40%～50%[1],其中由大肠杆菌K99引发的牛腹泻最为严重。大肠杆菌K99通过促进细菌菌毛粘附于畜体空肠或回肠表面的糖蛋白上,定植产生肠毒素对畜体上皮细胞造成损害,导致肠内液体分泌和电解质紊乱,进而引发动物腹泻脱水甚至死亡[2]。

近年来,学者们对牛腹泻疾病的研究越来越多。Al Mawly等[3]对新西兰 97 个奶牛场中1～5 日龄和 9～21 日龄犊牛1 283份粪便样品进行标准化检测;张坤[4]用 ELISA 方法和RT-PCR的方法对新疆北疆7个主要规范化奶牛场腹泻犊牛进行轮状病毒感染调查;岳山[5]对黑龙江不同地区肉牛场犊牛腹泻粪样分离鉴定的 71 株大肠杆菌进行毒力基因检测,K99 和另2种独立基因检出率为1.41%。然而针对大肠杆菌K99引发的牛腹泻调查较少。本研究从呼和浩特市周边地区规模化牛场采集样品对大肠杆菌 K99的流行情况进行调查分析,为有效制定疫病防控措施,促进市养牛产业健康持续发展提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品采集

呼和浩特市周边7个规模化牛场随机采集380份血样和粪样,记录背景信息。血样在室温放置2 h或 4 ℃冰箱过夜,取上清备用。粪样用生理盐水稀释备用。

1.2 主要试剂和仪器

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;DNA提取试剂盒购自哈尔滨元亨生物药业有限公司;K99 ELISA抗体检测试剂盒购自比利时BIO-X公司;标准菌株CVCC 209购自中国兽药监察所。

1.3 引物合成

参考文献[6]引物序列,由上海生物工程技术服务有限公司合成,目的片段314 bp。

1.4 规模化牛场粪样大肠杆菌K99抗原检测

采用PCR方法对380份粪样进行K99菌毛基因特异性扩增。

按照DNA提取试剂盒说明书,提取粪样DNA做为模板,用合成的引物进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系为:DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,Taq酶12.5 μL,无酶水8.5 μL。PCR反应条件为:预变性95 ℃ 5 min,变性94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环30次;延伸72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 规模化牛场大肠杆菌K99血清抗体检测

采用ELISA方法,按照K99 ELISA抗体检测试剂盒说明书操作检测380份血清样品。

1.6 细菌分离鉴定

PCR检测阳性的样品涂于伊红美蓝培养基表面,37 ℃培养18 h;挑取单个菌落进行纯化,革兰氏染色镜检观察菌体特征。

1.6.1 生化鉴定 将伊红美蓝培养基鉴定为阳性的菌株分别接种于侧金盏花醇、葡萄糖(产气)、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、木糖、尿素酶、棉子糖、山梨醇、三糖铁、苯丙氨酸、半固体琼脂、葡萄糖酸盐、枸橼酸盐、硫化氢、MR-VP生化鉴定管,观察反应管的现象,鉴定其生化特性。

1.6.2 PCR扩增与测序鉴定 按照DNA提取试剂盒说明书分离菌株,提取细菌DNA,进行PCR扩增。目的条带PCR产物进行测序。

1.7 药敏试验

采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验,根据临床试验室标准化协会(CLSI)标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 规模化牛场粪样大肠杆菌K99抗原检测结果

将380份粪样进行大肠杆菌K99菌毛基因PCR扩增,25份样品扩增出314 bp特异性片段,阳性率为6.58%(25/380)。部分PCR扩增结果如图1、图2。

图1 粪样PCR扩增结果 M:DL500bpMarker;1:参考菌株CVCC209;2:阴性对照;3～13:待检样品Fig. 1 PCR amplification results of fecal samples M. DL500bpMarker;1. Reference strain CVCC209;2. Negative control;3～13. Samples to be detected

图2 粪样PCR扩增结果 M:DL500bpMarker;1:参考菌株CVCC209;2:阴性对照;3～15:待检样品Fig. 2 PCR amplification results of fecal samples M: DL500bpMarker; 1: Reference strain CVCC209;2: Negative control; 3～15: Samples to be detected

2.2 规模化牛场大肠杆菌K99血清抗体检测结果

7个规模化牛场采集的380份血清K99抗体检测结果见表1。根据试剂盒说明书阳性判定标准,共检出阳性血清99份,总阳性率为26%。其中 0～2月龄犊牛阳性率为48.28%,2～6月龄的阳性率为18.18%,6～18月龄的阳性率为10%,成母牛的阳性率为10.77%。

表1 不同月龄的血清样品K99抗体检测结果Table 1 Serum prevalence at different months of age detected by K99 antibody

2.3 规模化牛场大肠杆菌K99流行病学调查结果

7个规模化牛场380份样品抗原抗体流行病学调查结果见表2。由表2可知,抗原阳性25份,阳性率为6.58%,抗体阳性99份,阳性率为26%。抗原抗体均为阳性12份,阳性率3.15%。

2.4 细菌分离鉴定结果

2.4.1 分离纯化结果 从25份PCR检测阳性样品中分离出83株疑似大肠杆菌,观察其在伊红美蓝平板上的形态。如图3所示,菌落表面光滑湿润,泛金属光泽,边缘整齐,整体轮廓为圆形凸起。镜检结果见图4,镜下可见呈红色两端钝圆短杆菌。

表2 K99流行病学调查结果Table 2 K99 epidemiological survey results

图3 伊红美蓝平板上大肠杆菌菌落形态Fig. 3 Morphology of strains on eosin methylene blue plate

图4 革兰氏染色镜检结果Fig. 4 Gram staining microscopic examination results

2.4.2 生化鉴定结果 将83株疑似大肠杆菌菌液接种于生化管,结果可见,83份样品均不产生硫化氢、苯丙氨酸脱氨酶和尿素酶,不能利用枸橼酸盐,在半固体琼脂上不能扩散生长;能使赖氨酸脱羧,但不能使鸟氨酸脱羧;能发酵山梨糖和木糖,但不能发酵侧金盏花醇和棉子糖;甲基红试验和吲哚试验均为阳性结果。以上反应结果均符合大肠杆菌的生化特性,说明83份菌液均为大肠杆菌。

2.4.3 PCR扩增结果 分离的83株疑似大肠杆菌中,采用PCR方法鉴定有8株含有K99菌毛基因,结果见图5、6。

图5 大肠杆菌K99 PCR扩增结果 M:DL500bpMarker;1:参考菌株CVCC209;2:阴性对照;3～12:不含K99菌毛基因;13～15:含K99菌毛基因Fig. 5 Amplification results of enterotoxin producing Escherichia coli k99PCR M: DL500bpMarker; 1: Reference strain CVCC209;2: Negative control; 3～12: Strains without K99 fimbriae gene; 13～15: Strains containing K99 fimbriae gene

图6 大肠杆菌K99PCR扩增结果 M:DL500bpMarker;1:参考菌株CVCC209;2:阴性对照;3～7,11:含K99菌毛基因的分离株;8～10,12:不含K99菌毛基因菌株Fig. 6 Amplification results of enterotoxin producing Escherichia coli k99PCR M: DL500bpMarker; 1: Reference strain CVCC209;2: Negative control; 3～7, 11: Strains containing K99 fimbriae gene; 8～10,12: Strains without K99 fimbriae gene

2.4.4 测序结果 利用Megalign软件与GenBank上登录的参考菌株进行比对分析,结果见图7。8株大肠杆菌K99分离株扩增目的基因序列与参考菌株的同源性在99.3%～100%之间,说明8株菌均携带菌毛抗原K99。

图7 分离菌株菌毛基因序列的同源性比较 1-8:样品,9、10:Genbank上公布的K99菌毛基因序列Fig. 7 Homogeneity comparison of the sequence of isolated strain hair genes 1-8: Samples, 9, 10:Sequence of K99 fimbriae gene published in Genbank

2.5 药敏结果

药敏试验结果如表3所示。根据临床试验室标准化协会(CLSI)标准判定结果可知,分离到的8株大肠杆菌K99对庆大霉素、环丙沙星、链霉素、丁胺卡那、卡那霉素敏感。

表3 药敏试验结果Table 3 Susceptibility test results

3 讨 论

随着呼和浩特市养牛业的不断发展,牛场养殖密度不断增加,由大肠杆菌K99引发的牛腹泻愈发严重。本研究从病原学和血清学2个方面对呼和浩特7个规模化养殖场进行K99流行情况调查,从380份粪样检测出25份疑似携带K99菌毛基因。通过对病原分离培养、生化鉴定、分子生物学鉴定,从25份PCR阳性样品中分离出83株疑似大肠杆菌,其中8株鉴定含有K99菌毛基因。ELISA检测K99血清抗体总阳性率为26%,其中 0～2月龄犊牛阳性率为48.28%,2～6月龄的阳性率为18.18%,6～18月龄的阳性率为10%,成母牛阳性率为10.77%。

通过对呼和浩特市周边规模化牛场抗原抗体的流行情况进行调查,表明该地区牛场存在大肠杆菌K99的感染,且高发于0～2月龄的犊牛。K99感染可能与母体抗体减少导致新生犊牛免疫低下有关,刚出生的犊牛抗体保护尚不充分,若初乳饲喂不足,犊牛胃肠道吸收能力弱,更易受到大肠杆菌 K99的感染。犊牛补充日粮后,机体的蛋白质能量充足,饲料中含的维生素如维生素A、维生素D、铜、硒、铁等有助于犊牛机体对病原菌的抵抗[7]。DE LA FUENTE等[8]研究表明,GM3是小肠黏膜上主要的神经节普脂,K99附着于此。随着月龄的增加,GM3的表达量减少,所以2～6月龄、6～18月龄、成母牛的抗体阳性率都低于0～2月龄,这可能也是K99容易引起犊牛腹泻的原因之一。

大肠杆菌K99引发的腹泻严重影响犊牛的生长发育和存活率,不及时治疗会造成犊牛死亡,导致育肥牛场经济损失。本研究中,呼和浩特市周边地区牛场存在大肠杆菌K99的感染,高发于0～2月龄犊牛。养殖户也应注意新生犊牛的初乳喂养和管理因素。新生犊牛对大肠杆菌感染的被动免疫和抵抗力与初乳喂养密切相关[9],通过初乳被动获得免疫是预防犊牛腹泻病的主要因素。同时也要加强牛场饲养管理,如畜群规模和环境温度、消毒牛群喂养设备。正确认识牛腹泻的发病原因,对因处理,对症治疗,重视预防,加强饲养管理,才能从根本上减少牛腹泻的发生。

4 结 论

呼和浩特市周边规模化牛场存在大肠杆菌K99的感染,病原阳性率6.58%,血清阳性率为26%,阳性血样多集中于0～2月龄犊牛。菌毛基因PCR测序鉴定出8株K99菌株,分离株对庆大霉素、环丙沙星、链霉素、丁胺卡那、卡那霉素敏感。