不同种源福建柏叶精油得率及成分分析

陈美璇, 黄 霞, 李秉钧, 荣俊冬, 郑郁善, 陈礼光

(福建农林大学 林学院,福建 福州 350002)

福建柏(Fokieniahodginsii),又名建柏、滇柏,是国家二级保护濒危植物,主要分布于越南以及中国西南部、南部至东部,以福建中部最多。始载于《经济植物手册》,据《中华本草》摘录福建柏心材含挥发油,以其心材作药材基源,具有行气止痛、降逆止呕的功效[1]。目前关于福建柏精油的研究主要集中于叶精油成分及其生物活性,主要采用水蒸气蒸馏法提取,并利用GC-MS对其成分进行分析,但前人的研究结果存在较大差异。潘炯光等[2]研究发现精油得率为0.5%,主要成分为α-蒎烯(24.89%)、柠檬烯(8.46%)、石竹烯氧化物(4.01%);张艳平等[3]研究得出福建柏精油的主要成分为β-橙椒烯(22.514%)、τ-杜松醇(19.883%)、石竹烯(10.133%)、γ-毕澄茄烯(8.307%)和α-杜松醇(5.519%);卢钰铎等[4]研究得出精油得率为0.12%,密度为0.736 g/mL,主要成分为α-蒎烯(29.25%)、马鞭烯醇(10.88%)和石竹烯氧化物(9.64%),精油对白纹伊蚊和致倦库蚊都有很好的毒杀作用,其生物活性与精油中所含的化学成分α-蒎烯和石竹烯氧化物有关;黄霞等[5]对福建柏不同部位的精油成分和含量进行了分析研究,发现福建柏叶精油和福建柏心材精油成分存在很大差异。现如今柏科植物精油早已广泛应用于医药、化工、农药等领域,福建柏所产生的挥发性气体具有一定的保健效果,福建柏叶精油虽然已逐渐用于化妆品[6]和灭蚊产品,但其康养效果和生物活性的研究仍具有深入研究的价值,在社会市场的开发应用中具有极大潜力。本研究采用超声波辅助的水蒸气蒸馏法提取不同种源的福建柏叶精油,通过GC-MS对精油的成分进行检测,对精油的得率、感官性状、成分及其GC含量进行分析比较,探究不同种源福建柏叶精油含量及其成分的差异性和相关性,筛选出更有应用价值的福建柏种源,以期为福建柏工业原料林营造和产业化生产提供参考,为福建柏叶精油开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福建柏(Fokieniahodginsii(Dunn) A. Henry et H. H. Thomas),鲜叶于2020年9月24日采自福建省安溪丰田国有林场,福建柏种源试验林(4年生)。选择中坡位、生长良好的标准木5株,将每株叶子分上、中、下3部分,各层取500 g混合后作为精油提取原料。无水硫酸钠,分析纯;正己烷,色谱纯,麦克林生化科技有限公司。

2010QP-PLUS气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪,日本岛津公司;超声波提取机,济宁天华超声仪器有限公司;0.45 μm的尼龙滤(Nylon)膜,天津市津腾实验设备有限公司;5 mL挥发油量管。

1.2 原料预处理和精油提取

新鲜福建柏叶-80 ℃冷冻保存,避免反复冻融,取出粉碎至粒度基本一致,取100 g放入1 000 mL圆底烧瓶,加入一定量去离子水,超声波处理一定时间后,加热至沸腾,再保持微沸,进行水蒸气蒸馏。收集提取液上层油状物质,无水硫酸钠干燥。所得淡黄色透明油状物,低温4 ℃暗保存备用。

1.3 精油提取工艺优化

在查阅文献及预实验基础上,以福建泉州安溪种源福建柏叶为原料,超声波功率240 W,按1.2节方法提取精油。通过单因素试验考察提取时间(沸腾后开始计时,2、 4、 6、 8、 10 h)、超声波处理时间(10、 20、 30、 40、 50 min)、液料比(3∶1、 4∶1、 5∶1、 6∶1、 7∶1,mL∶g,下同)对福建柏叶精油得率的影响。在单因素试验基础上,进一步通过正交试验优化提取工艺条件。

1.4 精油成分GC-MS分析

取100 μL的精油溶于1 mL正己烷,过孔径为0.45 μm的Nylon膜,进行GC-MS成分测定,利用谱图库自动检索,结合人工筛选,鉴定出其主要成分,采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据分析。

色谱条件:HP-5MS石英弹性毛细管柱(30 m×250 μm ×0.25 μm);载气为超纯氦气;总流速40 mL/min,柱内流速1.0 mL/min,进样口温度250 ℃,进样量1 μL,分流比为50∶1,GC和MS接口温度270 ℃。升温程序:柱温40 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速率升温至100 ℃,再以20 ℃/min升温至140 ℃并保持2 min,最后以20 ℃/min的速率升温至250 ℃后,保持3 min。

质谱条件:电子轰击能量70 eV,离子源温度230 ℃,扫描范围(m/z)15～500,并采用峰面积归一化法初步定量。

1.5 得率计算

运用ISO 279—1998(参比法)在20 ℃时测定精油相对密度,以精油得率作为福建柏叶精油产量的评价标准,精油得率(y)计算公式如下:

y=m1/m0×100%

式中:m0—样品质量,g;m1—精油质量,g。

2 结果与讨论

2.1 不同条件对精油得率的影响

2.1.1提取时间 在液料比5∶1、超声波处理时间30 min、超声波功率240 W条件下,提取时间对精油得率的影响见图1(a)。由图可知,随着提取时间的延长,福建柏叶精油的得率有所增加,2～6 h增加迅速,6 h后增加变缓,8 h后略有减少。可能是因为前2 h内水分未能完全进入植物细胞,精油未能及时随蒸汽馏出,蒸馏时间大于8 h后,几乎无精油馏出,蒸汽还可能导致精油部分成分分解或精油随之挥发。综合考虑精油得率、时间成本、能源消耗,提取时间以8 h为宜。

a.提取时间extracting time; b.超声波处理时间ultrasonic treatment time; c.液料比ratio of liquid to material图1 不同条件对精油得率的影响Fig.1 Effect of different conditions on the yield of essential oil

2.1.2超声波处理时间 在液料比5∶1、提取时间6 h、超声波功率240 W条件下,超声波处理时间对精油得率的影响见图1(b)。由图可知,随着超声波处理时间的延长,精油得率也有所升高,超声波处理时间30 min时,得率达到最高值,随后缓慢降低。超声波处理时间过短,福建柏叶细胞壁破裂及胞内热效应程度低,精油无法完全溶出;但超声波处理时间太长会使温度升高,可能导致福建柏叶部分成分挥发,造成精油得率降低[7]。这与卢锟等[8]利用超声波辅助水蒸气蒸馏法提取蓝桉叶精油研究结果相似。故超声处波处理时间应为30 min。

2.1.3液料比 液料比会影响液体与物料的接触,合适的液料比能保持物料与水的接触,水蒸气能更好地带出精油[9]。在提取时间6 h、超声处波理时间30 min、超声波功率240 W条件下,液料比值对精油得率的影响见图1(c)。由图可知,随着液料比值增大,精油得率增加;当液料比值为4时,精油得率最高;当液料比值增大到5时,精油得率降低,但不显著(P>0.05);随着液料比值继续增大,精油分散在水中浓度会逐步减小,精油得率持续降低。故液料比选择4∶1。

2.2 正交试验结果优化

在单因素试验基础上,选取提取时间、超声波处理时间、液料比这3个因素,并加入空白列考察试验误差,采用L9(34)正交试验,以精油得率为评价指标,优化得到福建柏叶精油最佳提取工艺,正交试验设计及结果见表1。由表1中R值分析可知,RC>RA>RB,说明影响福建柏叶精油得率各因素的主次顺序为液料比>超声波处理时间>提取时间。最优组合为A2B2C1,并通过实验验证该组合下福建柏叶精油的得率为0.252%,与正交试验结果相近,证明正交优化有效。因此,福建柏叶最佳提取工艺为超声波处理时间30 min、提取时间8 h、液料比3.5∶1。

表1 精油提取的正交试验设计及结果Table 1 Orthogonal test design and results for extraction of essential oil

2.3 不同种源福建柏叶精油提取结果和性状分析

由表2可以看出,不同种源的福建柏叶精油得率具有显著差异(P<0.05)。

表2 不同种源福建柏叶精油得率及感官性质差异Table 2 Difference of essential oil yield and sensory properties of F. hodginsii leaves from different provenances

即使是同省不同市,如2号与1、 3号种源,11号与福建省其他种源的精油得率均存在显著差异,甚至同市不同县也可能存在显著差异如9和10号。前期试验发现在树上部(顶部)与下部(靠地面)采摘的叶精油得率相当,中部精油得率相对较少但不显著。不同种源福建柏叶精油的得率存在显著差异,同省不同市也存在较大差异,精油得率最高的是福建三明大田(0.290%),广西来宾金秀精油得率最低(0.153%),精油得率较高者大多精油颜色较浅、澄清、香味较淡,精油得率较低者则反之,这可能是受种源地的不同,精油成分中挥发性萜类物质的含量存在差异,使得精油的气味和所呈颜色存在差异。

2.4 不同种源福建柏叶精油成分分析结果

2.4.1GC-MS分析 精油经过GC-MS分析后,通过谱图库自动检索,进一步人工匹配筛选出相似度90%以上,且稳定存在的成分,再通过面积归一法计算得到各化学成分的GC含量。如图2和表3所示,各种源精油成分相似,主要为倍半烯萜类,但主要成分(GC含量大于1%)GC含量有较大的差异,如在时间为17.5 min左右分离出的化学成分刺柏烯醇仅在种源福建泉州安溪、漳州华安、三明大田、龙岩上杭和龙岩长汀叶精油中大量存在,其余种源未检出或GC含量远低于1%;重庆江津种源精油成分与其他种源也有较明显差异,(+)-表双环倍半水芹烯和α-杜松醇为独有的主要成分,β-荜澄茄烯、β-榄香烯和γ-依兰油烯的GC含量也高于其他种源,但α-蒎烯、β-蒎烯和β-石竹烯的GC含量远低于其他种源,其中α-蒎烯的GC含量仅高于广西来宾金秀。

表3 不同种源福建柏叶精油主要成分GC含量Table 3 GC content of the main components of essential oil of F. hodginsii from different provenances %

图2 CT(a)和GY(b)种源福建柏叶精油的总离子流色谱Fig.2 TIC of F. hodginsii leaf essential oils from provenances of CT(a) and GY(b)

2.4.2主成分分析 不同种源福建柏叶精油成分的方差分解和载荷矩阵结果见表4。

表4 福建柏叶精油成分指标的主成分分析Table 4 Principal components analysis of essential oil components indexes in the leaves of F. hodginsii

由表4可知,叶精油成分可分为5个主成分,载荷解释原有变量贡献率达88.613%。第一主成分贡献率为29.032%,其中贡献较大的是α-杜松醇、γ-依兰油烯、β-杜松烯、β-榄香烯;第二主成分贡献率为19.530%,其中贡献较大的是γ-杜松醇、τ-杜松烯和1-辛烯-3-醇,第三主成分贡献率为19.432%,其中贡献较大的是β-蒎烯、β-荜澄茄烯、β-石竹烯;第四主成分贡献率为10.554%,其中贡献较大的是β-月桂烯、刺柏烯醇;第五主成分贡献率为10.066%,其中贡献较大的是D-柠檬烯。这12个成分影响着不同种源福建柏叶精油质量。

各种源福建柏叶精油在每一主成分上的得分(FAC),计算得到综合得分(F),结果见表5。

表5 不同种源叶福建柏精油新变量值1)Table 5 New variable values of different provenances essential oil of F. hodginsii

根据得分可直观反映出各种源地成分差异,可分为含不同主成分类别。得分为正则表示与负荷量表值正相关,为负则为负相关;若同一种源地某主成分得分较高,则表示对该主成分贡献率较为突出;某主成分最大值所对应的种源为含该主成分最高的种源。不同种源福建柏叶精油主成分及其GC含量综合得分最高种源地为广西来宾金秀,与其他种源精油相比其α-蒎烯和β-蒎烯含量较低;综合得分最低为福建莆田仙游,与其他种源精油相比其α-蒎烯含量较高、β-蒎烯较低。

2.4.3聚类分析 基于不同种源福建柏叶精油主成分采用分层聚类法进行聚类分析。采用离差平方和法利用欧氏距离作为样品的测度[10-11],每2个样本间用类间平均联锁法链接,获得分层聚类分析图,结果见图3。

图3 14个种源福建柏叶精油聚类树形Fig.3 Cluster tree diagram of F. hodginsii leaf essential oil obtained from 14 provenances

当欧氏平方距离(NUM)=20时,可将不同种源福建柏叶精油成分聚类为3类:第一类为5号样品组成,第二类由9号和14号样品组成,第三类由其余11组样品组成,表明5号重庆江津种源与其他种源精油成分及其GC含量差异较大,其中与福建福州永泰、福建三明大田、广西桂林灌阳和广西南宁大明山这4个种源差异最大。

当NUM=15时,可将不同种源福建柏叶精油成分聚类为3类:第一类由5号样品组成,第二类由9、 14号2组样品组成,第三类由其他11组样品组成。

当NUM=10时,可将不同种源福建柏叶精油成分聚类为6类:第一类由5号样品组成,第二类由9、 14号2组样品组成,第三类由2号样品组成,第四类由4、 12、 6、 10号4组样品组成,第五类由7、 8号2组样品组成,第六类由1、 3、 13、 11号4组样品组成。第六类均为福建、广西省区内的种源样品组成,第五、第四和第二类主要为福建省内种源,第三和第一类为单独的广西种源和重庆种源。

当NUM=5时,进一步将福建省内9个种源精油成分聚类为7类:只有龙岩长汀与漳州华安、福州闽清与泉州永春各聚为一类,其他福建省的种源地全部分为单独或与其他省份种源为一类,如广西桂林灌阳、广西南宁大明山与福建福州永泰聚为一类,广西来宾金秀单独为一类,与广西另外2个种源叶成分及其GC含量差异较大。

重庆江津福建柏叶精油成分及其GC含量与其他种源差异明显;福建省内福建柏叶精油成分及其GC含量具有相关性和差异性,龙岩长汀和漳州华安与福建省其他种源相关性较弱,但种源地理位置相近的福建柏叶精油均有较强的相关性;广西来宾金秀,与其他2个广西种源精油成分及其GC含量差异性较大;广西的桂林灌阳和南宁大明山,以及广东深圳南岭种源均与福建种源叶精油成分有较强的相关性。

2.5 讨论

造成植物体内精油主要成分及其GC含量不同的原因是多方面的,除生长环境(土壤、气候、季节等)、树龄、采集部位、采集运输过程和提取工艺等外在因素以外,植物种源不同也是造成精油主要化学成分及其GC含量差异的主要因素[12-16]。当环境因子一定、正常生长时,基因控制着福建柏叶精油的成分及其GC含量,表明福建柏叶精油主要成分及其GC含量受遗传基因影响显著。福建柏叶精油中α-蒎烯的GC含量较高,约占总成分的50%,与松针精油成分相似。松针精油的市场应用很广泛,因此福建柏叶精油同样具有很高的研究价值。α-蒎烯是合成香料的主要原料,主要用于合成松油醇、芳樟醇以及一些檀香型香料,也可用于日化产品以及其他工业品的加香,在工业上经常被用于合成润滑剂和增塑剂。α-蒎烯微毒,高浓度时会对人体造成危害。有研究发现体积分数高于50 mL/L时α-蒎烯对小麦中的害虫以及玉米中的玉米象和杂拟谷盗有较为理想的杀虫效果。α-蒎烯还具有抗腺病毒作用,为研发天然、高效、低毒的抗腺病毒药物提供了科学依据[17]。福建柏叶精油中β-蒎烯的GC含量占总成分的4%左右,有研究以β-蒎烯为原料,经化学反应制备了二氢枯茗酸酰胺等6类共45种新化合物,这些化合物中的大部分具有一定的抑菌作用以及一定的广谱抗菌性[18]。不同种源福建柏叶精油主要成分中α-蒎烯和β-蒎烯的含量差异较小,相较于其他种源地,广西各种源地的福建柏叶精油中α-蒎烯和β-蒎烯含量较高,这可能是受种源地遗传基因的影响。

3 结 论

3.1通过单因素试验和正交试验设计优化,得到福建柏叶精油超声波辅助水蒸气蒸馏提取的最佳工艺条件为:液料比3.5∶1(mL∶g)、提取时间8 h,超声波处理时间30 min和超声波功率240 W。此条件下,精油得率为0.252%。

3.2不同种源福建柏叶精油得率、主要成分及其GC含量的差异显著,精油得率较高的种源为福建三明大田、广西南宁大明山、广西桂林灌阳,主要成分GC含量较高的种源为广西南宁大明山、福建三明大田、广东深圳南岭,影响福建柏叶精油品质的主要成分为α-杜松醇、γ-依兰油烯、β-荜澄茄烯、β-榄香烯、β-杜松烯、γ-杜松烯、τ-杜松醇、β-蒎烯、β-石竹烯、D-柠檬烯、刺柏烯醇、β-月桂烯。地理位置相距较近种源间福建柏叶精油成分及其GC含量相关性较强,表明福建柏叶精油得率、化学成分及其GC含量受基因遗传因素影响显著,并有稳定遗传可能。

3.3不同种源福建柏叶精油主成分综合得分最高种源地为广西来宾金秀,α-蒎烯含量较低;综合得分最低为福建莆田仙游,α-蒎烯含量较高。根据福建柏叶精油得率、主要成分GC含量,种源广西南宁大明山、福建三明大田均为较合适选择,可用于早期选育品种,其精油成分更具有生产价值,可以为福建柏工业原料林营造和产业化生产提供参考,为福建柏精油开发提供理论依据,从而充分发挥福建柏的应用价值。