基于UPLC-Q-Orbitrap-HRMS 技术鉴定护心胆中异喹啉类生物碱成分

刘 畅，周 熙，罗辉泰，黄 芳，吴惠勤

（广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070）

护心胆（又名红花鸡距草，紫花荷苞牡丹），为罂粟科紫堇属植物Corydalis sheareriS. Moore 的新鲜或干燥块根，收载于《广西实用中草药新选》，具有活血止痛、清热解毒等功效，民间常用于治疗腹痛泄泻、跌打损伤、痈疮肿毒、目赤肿痛、胃痛等［1-2］。现代药理学及临床研究表明，护心胆对毒蛇咬伤引起的疼痛具有治疗效果，且具有抗病毒、抗肿瘤活性［3-5］。异喹啉类生物碱（Isoquinoline alkaloids，IQAs）是其主要的抗炎活性成分，小檗碱［6］、药根碱［7］等能够明显改善溃疡性结肠炎症状。但目前对护心胆中生物碱类成分的报道仅有原阿片碱、毕扣扣灵、南天竹碱、别隐品碱及紫堇块茎碱［8-9］，未有全面分析。为探寻护心胆中更多治疗结肠炎的生物碱类成分，本研究采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap-HRMS）技术分析护心胆中IQAs 成分，为护心胆的后续研究开发提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

赛默飞Orbitrap Exploris 120型高分辨质谱仪、FreeStyleTM1.8 SP2 数据处理系统（美国 Thermo Fisher公司）。赛多利斯TP-114 电子天平（美国Sartorious 公司）；KQ2200 型台式机械超声波清洗器（东莞市超声波设备有限公司）。

1.2 材料与试剂

护心胆（批号20220519）购自广州市中药材市场，经鉴定为罂粟科紫堇属植物Corydalis sheareriS.Moore的干燥块根；甲醇、乙腈为色谱纯试剂（德国Merck公司）；蒸馏水由屈臣氏集团提供；其余试剂为分析纯。对照品四氢小檗碱（批号RFS-S08901905023）、表小檗碱（批号RFS-B06411812016）、四氢黄连碱（批号RFS-S11311802012）、黄连碱（批号 RFS-H08501910006）、甲基黄连碱（批号RFSJ0261912012）、巴马汀（批号 RFS-H01501906015）、原阿片碱（批号RFS-Y05211812016）、别隐品碱（批号RFS-B05911804026）、木兰花碱（批号RFS-M02611811022）、延胡索甲素（批号 RFSY15811812016）、延胡索乙素（批号110726-201819）、非洲防己碱（批号 RFS-F02911807017）、两面针碱（批号RFS-L03111812016）、脱氢紫堇碱（批号RFS-T03302104008）、白屈菜红碱（批号RFSB04202006024）、药根碱（批号RFS-Y05202006001）、血根碱（批号RFS-W01002006015）、二氢血根碱（批号RFS-R06002002009）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，去甲乌药碱（批号STC2400120）、盐酸小檗碱（批号RS-03071120）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，以上对照品质量分数均大于98%。

1.3 样品制备

将护心胆药材粉碎，精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入20 mL 50%甲醇水溶液，称定质量，浸泡30 min，超声提取30 min，冷却。再次称定质量，用50%甲醇水溶液补足损失的质量，摇匀，静置，取上清液过滤，滤液待上机分析。

分别精密称取各对照品适量，用甲醇溶解制备对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得1 mg/L对照品溶液。

1.4 液相色谱条件

采用 Poroshell RRHD C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相为 0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～2 min，10% B；2～10 min，10%～60% B；10～15 min，60%～95% B；15～17 min，95% B；17.1～20 min，95%～10% B。流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为1 µL，紫外检测波长为250 nm。

1.5 质谱条件

使用加热电喷雾离子源（HESI），正离子模式检测，鞘气流速为50 L·min-1，辅助气流速为10 L·min-1，喷雾电压为3.5 kV，毛细管温度为325 ℃，辅助器温度为350 ℃；扫描模式为数据依赖的二级质谱数据采集模式（dd-MS2），扫描范围为m/z200～700，源内裂解电压为30 V，碰撞能量为20、40、60 eV。数据采集时间为20 min。

1.6 数据分析

有对照品的化学成分通过对照品保留时间、精确质量数与二级质谱图等信息进行确认。无对照品的化学成分，通过一级精确质量数、二级碎片裂解规律，同时结合PubChem 质谱数据库以及FreeStyleTM1.8 SP2 软件进行定性分析。对于文献中未报道，但在总离子流谱图中出现的化学成分通过一级质谱的分子离子峰准确质量数推测化学式，再根据二级碎片，结合紫堇属中药材的化学成分种类，推测可能的结构式。

2 结果与讨论

2.1 异喹啉类生物碱成分的鉴别

为便于对护心胆中IQAs 化学成分进行分析，首先从CNKI、GoogleScholar、Scifinder 等数据库中检索护心胆的化学成分，再通过Chemspider、Chembook、Massbank、Pubmed等数据库获取对应化学成分的信息，包括化合物的名称、分子式、相对分子质量等，以建立护心胆的IQAs化合物数据库。经查阅相关文献［10-11］，结合一级、二级质谱图以及对照品信息，明确不同类型IQAs 的裂解规律。结合其特征二级碎片、三级质谱图、保留时间特征等参数对护心胆中IQAs 进行了全面鉴定。在此基础上，采用UPLC-Q-Orbitrap-HRMS 在正离子模式鉴定出62 个生物碱（见表1），包括15 个原小檗碱型生物碱、15个四氢小檗碱类生物碱、14 个苄基异喹啉类生物碱、3 个阿朴菲类生物碱、6 个普罗托品类生物碱、7个苯并菲啶类生物碱、2个二氢苯并菲啶类生物碱。护心胆提取物的总离子流色谱图（TIC）如图1所示。

表1 护心胆中异喹啉类生物碱成分的鉴定结果Table 1 Identification of isoquinoline alkaloids constituents of Corydalis suaveolens Hance

2.2 原小檗碱类生物碱、苯并菲啶类生物碱与二氢苯并菲啶类生物碱

原小檗碱类生物碱、二氢苯并菲啶类生物碱与苯并菲啶类生物碱均具有大的共轭结构，其母核在质谱中通常不会发生裂解。原小檗碱类生物碱的C5与C6位置的碳碳单键易脱去2个H，形成更大的稳定的大π 共轭体系，所以原小檗碱类生物碱的母核通常不会发生裂解，主要碎片离子由小分子取代基的掉落形成，较少存在低于m/z230的产物离子。当取代基包含2个或多个甲氧基时，特征碎片离子为［M-CH4］+、［M-CH3］+和 ［M-2CH3］+，如小檗碱和巴马汀［11］。结合碎片离子及文献，鉴定出15 个原小檗碱类生物碱，分别为化合物22、23、25、26、29、35、38、40、42、45、49、51、52、55和58。

化合物52 为小檗碱，分子式为C20H18NO4+，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z336.123 0［M］+。小檗碱含有邻二甲氧基，产生特征碎片离子m/z321.099 3 ［M-CH3］+、306.076 0［M-CH4］+，在二级质谱中还可观察到由m/z320.091 6［M-CH4］+相继失去CO 产生的碎片离子m/z292.096 8［M-CH4-CO］+。其裂解途径见图2。

苯并菲啶类生物碱母核结构具有稳定的双键共轭系统，很难发生裂解，主要的裂解为一些取代基的丢失。根据其取代基，丢失CH3、CH2O、CO 等一系列取代基的二级碎片，易形成m/z317.067 9、332.091 0、304.095 1、290.082 6 等一系列特征碎片离子［12-14］。通过提取该系列特征碎片离子实现苯并菲啶类生物碱的快速识别。结合碎片离子及文献，鉴定出7个苯并菲啶类生物碱，分别为化合物31、50、54、56、57、59、60。

化合物50为血根碱，分子式为C20H14NO4+，正离子模式下的准分子离子峰为m/z332.091 7［M］+，根据其取代基，会产生m/z317.067 9［M-CH3］+、304.096 8［M-CO］+，在二级碎片中还可看到由碎片离子m/z304.096 8［M-CO］+脱去1个CH2O后的碎片离子m/z274.086 3［M-CO-CH2O］+。其裂解途径见图3。

二氢苯并菲啶类生物碱与原小檗碱类生物碱的质谱裂解规律相似。二氢苯并菲啶类生物碱先丢失7位或8位的取代基形成相对较稳定的苯并菲啶类生物碱结构，后续的裂解规律与苯并菲啶类生物碱的裂解规律一致［15-17］。

化合物62为二氢血根碱，分子式为C20H15NO4，正离子模式下准分子离子峰为m/z334.107 1。在二级质谱中，可观察到其丢失1个CH4的特征碎片离子m/z318.075 9［M-CH4］+，脱去CH3后的特征碎片离子m/z319.083 7［M-CH3］+，脱去CH2O 形成的m/z304.100 0［M-CH2O］+及其丢失CO 产生的碎片离子m/z276.102 1［M-CH2O-CO］+。其裂解途径见图4。

图4 二氢血根碱的裂解途径（A）与MS/MS图（B）Fig.4 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of dihydrosanguinarine

2.3 四氢小檗碱类生物碱

四氢小檗碱类生物碱易发生RDA 裂解，生成较小的二级碎片。同时，根据苯环上取代基的不同，生成丢失CH3、CH4、CH2O、CO 等一系列取代基的二级碎片。根据取代基的不同，四氢小檗碱类生物碱易形成m/z164.070 6、176.070 6、178.086 3、190.086 3、192.101 9、206.117 6等一系列特征碎片离子［18-20］。结合碎片离子及文献，共鉴定出15个四氢小檗碱类生物碱，分别为化合物 13、17～20、24、27、32、37、39、43、44、46、47和53。

化合物18为紫堇单酚碱，分子式为C20H23NO4，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z342.170 0［M＋H］+，经过逆狄尔斯-阿德尔（RDA）裂解，会产生丰度较高的特征碎片离子m/z192.101 8［M-C9H10O2］+，在二级质谱中还可观察到由碎片离子m/z192.101 8［M-C9H10O2］+丢失1 个中性碎片CH3后的碎片离子m/z177.078 3［M-C9H10O2-CH3］+。其裂解途径见图5。

图5 紫堇单酚碱的裂解途径（A）与MS/MS图（B）Fig.5 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of corydalmine

2.4 苄基异喹啉类生物碱

苄基异喹啉类生物碱的二级质谱碎裂存在两个明显特征：（1）发生α裂解，生成m/z100～200 的二级碎片；（2）根据N 上含有的甲基数量不同，可生成［M+H-NH（CH3）2］+、［M+H-NH2（CH3）］+、［M+HNH3］+等不同形式的裂解碎片。同时，在较低的质荷比范围具有C3H8N+（m/z58.065 1）与C2H6N+（m/z44.049 5）的特征碎片离子。发生α裂解后，根据取代基不同，可产生m/z107.049 1、137.059 7、123.044 1、121.064 8、151.075 4 等离子碎片［21-22］。依据碎片信息及文献，从护心胆中共鉴定出14 个苄基异喹啉类生物碱，分别为化合物1～6、8、10、12、14～16、21和41。

化合物5 为乌药碱，分子式为C17H19NO3，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z286.143 8［M+H］+。在二级质谱中，可观察到母核断裂后的特征碎片离子m/z107.048 9，脱去氨基后的特征碎片离子m/z269.117 4［M-NH3］+，乌药碱中存在相邻的羟基和甲氧基结构，还会失去CH3OH 从而形成m/z237.091 4［M-NH3-CH3OH］+。其裂解途径见图6。

2.5 阿朴菲类生物碱

阿朴菲类生物碱的N 上可连接0～2 个甲基，其质谱裂解规律与苄基异喹啉类生物碱一致，根据N上含有的甲基数量不同，可生成［M+H-NH（CH3）2］+、［M+H-NH2（CH3）］+、［M+H-NH3］+等不同形式的裂解碎片。同时，在较低的质荷比范围产生m/z58.0651与44.049 5的特征碎片离子。但阿朴菲类生物碱具有较大的共轭结构，其母核结构不易发生断裂，不会形成m/z较小、丰度较大的碎片离子［23-25］。结合碎片离子及文献，共鉴定出3个阿朴菲类生物碱，分别为化合物7、9、34。

化合物9 为木兰花碱，分子式为C20H24NO4+，在正离子模式下，准分子离子峰为m/z342.170 0［M］+。木兰花碱含有NH（CH3）2结构，会形成特征离子碎片m/z297.112 0［M-NH（CH3）2］+。在二级质谱中可观察到其丢失1 个CH3得到的m/z282.088 5 ［M-NH（CH3）2-CH3］+及掉落CH4O 产生的m/z265.085 8［M-NH（CH3）2-CH4O］+。碎片离子m/z265.085 8 在断裂的过程中发生异构化，相继失去CO 和CH3形成碎片离子m/z237.090 8［M-NH（CH3）2-CH4O-CO］+。其裂解途径见图7。

图7 木兰花碱的裂解途径（A）与MS/MS图（B）Fig.7 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of magnoflorine

2.6 普罗托品类生物碱

普罗托品类生物碱不存在大π 共轭系统，母核易发生断裂，经RDA 裂解形成小分子片段。羰基上的O易发生脱水，母核失去1分子H2O形成稳定的4环结构，［M＋H-H2O］+的碎片峰是普罗托品类生物碱区别于其他IQAs 的最重要特征。同时，由于N 上含有甲基，易形成C2H6N+（m/z44.049 5）的特征碎片［26-27］。结合碎片离子及文献，共鉴定出6 个普罗托品类生物碱，分别为化合物11、28、30、33、36、48。

化合物30为原阿片碱，分子式为C20H19NO5，正离子模式下，准分子离子峰为m/z354.133 5。母核发生脱水，失去1 个H2O 产生m/z336.122 7［M-H2O］。经过RDA 裂解，形成碎片离子m/z206.081 1［M-C9H7O2］+，继续丢失1 个OH 后产生碎片m/z189.078 4［M-C9H7O2-OH］+，或脱去1 个H2O 后产生m/z188.070 5［M-C9H7O2-H2O］+。其裂解途径见图8。

图8 原阿片碱的裂解途径（A）与MS/MS图（B）Fig.8 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of protopine

护心胆作为地方用药，具有解毒、止痛、消肿的功效，民间常以捣敷或嚼服用于治疗跌打损伤、痈疮肿毒、胃痛以及毒蛇咬伤，展现出良好的应用价值。护心胆与紫堇属多数中药材存在相似的化学组成，主要含生物碱类成分，异喹啉类生物碱可能是其主要的活性成分之一，具有广泛的药理活性［28］。然而，目前其异喹啉类生物碱组成尚未明确。

护心胆中含有的小檗碱、巴马汀、木兰花碱具有抗炎、抗氧化应激和抗菌等多种活性，在治疗肠胃炎症、胰腺炎、肾病综合征、关节炎等疾病方面具有重要作用［29-31］。药根碱可以抗动脉血栓和静脉血栓，其可能主要通过作用于内源性凝血途径而发挥抗血栓作用［32］。本实验对护心胆的异喹啉类生物碱进行全面鉴定，阐明了护心胆中的主要化学物质组成，为进一步明确其药效物质基础、质量控制以及作用机制研究奠定了基础。

3 结 论

UPLC-Q-Orbitrap-HRMS 技术可通过其精确质量数及二级质谱图结合化合物的质谱裂解规律与质谱数据库快速鉴定化合物成分，是中药有效成分定性分析的最有效手段之一。本研究首次采用该技术在正离子模式下采集护心胆甲醇提取物的色谱质谱图，并对色谱图中的各个色谱峰进行精确质量数识别。以紫堇属中药材中已知的不同类型异喹啉类生物碱作为参照，同时结合保留时间、相对分子质量、二级质谱碎片离子、相关文献，共鉴定出62 个异喹啉类生物碱，包括15 个原小檗碱型生物碱、15 个四氢小檗碱类生物碱、14 个苄基异喹啉类生物碱、3 个阿朴菲类生物碱、6 个普罗托品类生物碱、7 个苯并菲啶类生物碱、2 个二氢苯并菲啶类生物碱。本研究对护心胆中异喹啉类生物碱成分进行全面系统的解析，为其成分分析、药效物质基础研究及质量控制提供了科学依据。