冷暴露对内毒素性急性肺损伤小鼠TLR4信号通路的影响

齐佳悦,李 妍,吴明达,冯宪敏,万 朋,骆晓峰,朱文赫,吕士杰,谢 维,高俊涛

(1.吉林医药学院附属医院,吉林 吉林 132013 ; 2. 吉林医药学院基础医学院,吉林 吉林 132013)

急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由多种因素(包括创伤、肺炎、休克和败血症等)引起的急性的、危及生命的疾病,是临床上发病率和死亡率极高的疾病[1,2]。ALI的特点是过度的炎症反应,中性粒细胞过度浸润,肺组织释放促炎细胞因子,肺泡毛细血管内皮细胞和上皮细胞损伤,引起水肿和气体交换异常[3-5]。引起ALI的一个主要原因是内毒素血症和细胞毒性途径激活,导致急性呼吸窘迫,最终引发多器官功能障碍综合征[6]。急性肺损伤通常较早发生并迅速发展,这是败血症患者最直接的死亡原因之一[7,8]。炎症被认为是急性肺损伤发生的诱因[9]。虽然环境低温与呼吸道感染易感性之间的关系已被普遍接受,但环境低温对肺部反应性炎症的影响,冷应激与肺部炎症严重程度之间的关系及其可能机制尚未得到充分研究。本试验旨在为冷暴露与肺功能的关系提供新的理论依据,同时为抗低温机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),购自美国Sigma公司;Mouse IL-6 ELISA试剂盒和Mouse TNF-α ELISA试剂盒,均购自英国Abcam公司;Anti-GAPDH抗体和Anti-TLR4抗体,均购自美国Cell Signaling Technology公司;RAPI 组织和细胞裂解液,均购自北京索莱宝科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,购自碧云天生物技术有限公司;聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluorid,PVDF)膜,购自美国Millpore公司。

1.2 主要仪器 电子天平,德国Sartorius公司产品;Pathological切片机,德国孚光精仪有限公司产品;旋涡混匀器,中国常州恩培仪器制造有限公司产品;TGL-16M 高速台式冷冻离心机,中国上海卢湘仪离心机厂产品;倒置显微镜,日本 OLYMPUS公司产品;化学发光成像系统,中国上海勤翔科学仪器有限公司产品。

1.3 实验动物分组和处理 选用40只清洁级健康BALB/c雄性小鼠[购自吉林大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(吉)2017—0007],体重35～40 g,动物试验经吉林医药学院伦理委员会批准(批准号:20170716)。将40只小鼠随机分为正常对照组(Normal control group,N组)、LPS组(Lipopolysaccharide group,L组)、冷暴露组(Cold exposure group,C组)和冷暴露+LPS 组(Cold exposure+Lipopolysaccharide group,C+L组),每组10只,其中L组和C+L组小鼠按0.5 mg/(kg·bw)鼻滴LPS,NS组和C组鼻滴等体积无菌PBS溶液,滴鼻后将C组和L组小鼠置于室温环境下,C组和C+L组小鼠置于(4±2)℃通风冷室,6 h后检测各项指标。

1.4 支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总蛋白浓度和白细胞数量检测 将各组小鼠使用乙醚进行麻醉,麻醉后的小鼠沿中线行气管切开术,然后将1 mL无菌注射器与无菌枪头连接(保持连接处密封),将500 mL PBS缓缓推入气管内,然后吸出,连续重复操作3次,合并3次收集的BALF。收集的BALF于4 ℃、3 000 r/min离心5 min,取上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组BALF上清液中的总蛋白浓度,具体操作严格按照试剂盒说明书步骤要求进行。将剩余沉淀中加入200 mL 红细胞裂解液,1 min后加入1 mL PBS,3 000 r/min离心3 min,弃上清(如果沉淀的红色很明显,可以重复以上操作),沉淀用 100 mL PBS重悬,取10 mL重悬液使用计数板计数白细胞。

1.5 BALF中促炎细胞因子TNF-α和IL-6含量检测 BALF上清液获取方法同1.4,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定BALF中 TNF-α和IL-6含量,具体操作严格按照试剂盒说明书步骤进行。

1.6 肺组织的湿干重比(Wet to dry weight ratio,W/D)检测 取小鼠左肺并用滤纸吸干其表面水分,电子天平精确称重,记录为湿重。然后将肺组织置于56 ℃烘箱中,3次称量恒重后,记录为干重,计算肺组织W/D,用以反映肺组织的水肿程度。

1.7 肺组织的组织病理学观察 肉眼观察各组肺组织水肿和出血点等变化,取右肺中叶,置于4%中性甲醛固定,常规石蜡包埋和切片,苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,H.E.)染色,置于光学显微镜下观察肺组织的组织病理学变化。

1.8 肺组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)蛋白表达量检测 采用 Western blot法检测小鼠肺组织中TLR4蛋白的相对表达量。于冰上取小鼠肺组织,剪碎后加入组织蛋白裂解液研磨,冰浴裂解 30 min,11 500 r/min(4 ℃,离心半径12 cm)离心20 min,吸取上清蛋白液,BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取40 mg蛋白样品经12% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离后转移至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的吐温-三羟甲基氨甲烷缓冲盐溶液(Tris buffer saline with tween,TBST)封闭2 h,加入相应一抗4 ℃孵育过夜。洗去多余一抗,将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的二抗孵育液中,37 ℃摇床孵育2 h。使用电化学发光(Enhanced chemiluminescence,ECL)底物液进行化学发光显影,通过Image-ProPlus测量蛋白条带的光密度。

1.9 统计分析 试验结果以“平均值±标准差(Mean±SD)”方式表示。采用 SPSS 20.0软件对数据进行统计分析,使用单因素方差分析法进行差异显著性检验。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 各组小鼠BALF中总蛋白浓度和白细胞数量比较 与N组比较,C组总蛋白浓度和白细胞数量无统计学差异(P>0.05),L组和C+L组总蛋白浓度和白细胞数量均极显著升高(P<0.01);与C组比较,C+L组总蛋白浓度和白细胞数量均极显著升高(P<0.01);与L组比较,C+L组总蛋白浓度和白细胞数量均明显升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各组小鼠BALF中TNF-α和IL-6含量比较 与N组比较,C组TNF-α和IL-6无统计学差异(P>0.05),L组和C+L组TNF-α和IL-6含量均极显著升高(P<0.01);与C组比较,C+L组TNF-α和IL-6含量均极显著升高(P<0.01);与L组比较,C+L组TNF-α和IL-6含量均明显升高(P<0.05)(表2)。

表2 各组小鼠BALF中TNF-α和IL-6含量比较Table 2 Comparison of TNF-α and IL-6 level in BALF of mice in each group (pg/mL,n=10)

2.3 各组小鼠肺组织W/D比较 与N组比较,C组肺组织W/D无统计学差异(P>0.05),L组和C+L组肺组织W/D均明显升高(P<0.05);与C组比较,C+L组肺组织W/D明显升高(P<0.05);与L组比较,C+L组肺组织W/D明显升高(P<0.05)(表3)。

表3 各组小鼠肺组织W/D比较Table 3 Comparison of lung W/D of mice in each group (n=10)

2.4 各组小鼠肺组织的组织病理学观察 与N组比较,C组H.E.染色结果正常,两者没有明显的差异,L组和C+L组肺组织发生组织病理学改变;与C组比较,C+L组出现了炎性细胞浸润、肺水肿、肺泡出血和肺泡间隔增厚,肺泡结构受损的情况;与L组比较,C+L组肺损伤更为严重(图1)。

图1 各组小鼠肺组织的组织病理学观察(H.E.染色,200×)Fig.1 Histopathological observation of lung tissues of mice in each group(H.E.staining,200×)A:正常对照组; B:冷暴露组; C:LPS组; D:冷暴露+LPS组(a:炎性细胞浸润; b:肺泡间隔增厚; c:肺水肿; d:肺泡出血)A:Normal control group; B:Cold exposure group; C:LPS group; D:Cold exposure+LPS group(a:Inflammatory cell infiltration; b:Alveolar septal thickening; c:Pulmonary edema; d:Alveolar hemorrhage)

2.5 各组小鼠肺组织中TLR4蛋白表达量比较 与N组比较,C组肺组织中TLR4蛋白表达量无统计学差异(P>0.05),L组和C+L组肺组织中TLR4蛋白表达量均明显升高(P<0.05);与C组比较,C+L组肺组织中TLR4蛋白表达量极显著升高(P<0.01);与L组比较,C+L组肺组织中TLR4蛋白表达量明显升高(P<0.05)(图2和表4)。

图2 各组小鼠肺组织TLR4蛋白表达水平Fig.2 Expression levels of TLR4 protein in lung tissues of mice in each group

表4 各组小鼠肺组织TLR4蛋白表达量比较Table 4 Comparison of TLR4 protein expression in lung tissue of mice in each group (n=5)

3 讨论

ALI可导致炎症介质大量合成和释放,最终造成肺实质性损伤。BALF中炎症因子的水平,如TNF-α和IL-6等促炎因子的释放,是评价肺部炎症反应程度的重要标志[10,11]。TNF-α是ALI最重要的启动因子之一,能够刺激肺组织中氧自由基和蛋白溶解酶的大量合成和释放,并可诱导中性粒细胞在肺内聚集和粘附,导致肺泡和毛细血管损伤,故其可反映肺组织损伤的严重程度[12-14]。IL-6是强有力的促炎细胞因子,能够放大肺部的炎症反应[15-17]。冷暴露会加重LPS诱导的肺损伤程度。

促炎反应在急性肺损伤发生过程中的重要性毋庸置疑。LPS 诱导促炎细胞因子产生,如TNF-α和IL-6等表达水平的激增,这可能使得中性粒细胞渗入到肺组织中,启动局部炎症反应。肺泡-毛细血管屏障因中性粒细胞的过度积累遭到破坏,使得毛细血管的通透性增加,从而使富含蛋白质的液体进入支气管血管周围间质,导致肺水肿。另外,白细胞在急性肺损伤的发病过程中也起着尤为重要的作用,其能引发炎症,参与形成肺损伤。本试验结果显示,小鼠BALF中总蛋白浓度、白细胞数量以及肺组织W/D在LPS刺激后显著上升,其中C+LPS组上升更加显著,肺组织H.E.染色的结果也验证了以上说法,说明冷暴露加重了小鼠肺损伤的程度。

ALI导致肺部发生炎症期间,气道上皮细胞(Airway epithelial cells,AECs)广泛表达不同Toll样受体,包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6(细胞外TLRs)以及TLR3、TLR7、TLR8和TLR9(细胞内TLRs)[18-20],从而激活下游信号通路。其中,关于TLR4的研究结果与本试验结果一致。本试验中,与正常对照组比较,LPS组TLR4蛋白表达量显著增加;与LPS组比较,冷暴露+LPS组TLR4蛋白表达量显著增加。组织病理学检测结果显示,冷暴露组已经出现炎症细胞浸润,LPS组出现肺泡间隔增厚和炎症细胞浸润,而冷暴露+LPS组中出现更为严重的肺泡间隔增厚和炎症细胞浸润,直至出现肺水肿和肺泡出血的严重病理改变,表明冷暴露加重了LPS诱导肺损伤的损伤程度。上述结果说明,TLR4参与了ALI的发展过程,冷暴露可能通过TLR4信号通路了加重LPS诱导的小鼠肺损伤。

TLR4信号传导与ALI产生的先天免疫和急性炎症有关[21]。LPS作为一种有效的炎症细胞毒性诱导剂,可能对包括心脏、肝脏、脾脏和肺脏在内的器官造成很多损害[22,23]。研究表明,TLR4是参与LPS诱导炎症反应的主要调节因子,其中TLR4作为LPS受体在ALI的发生发展过程中起主要作用[24],可促使肺损伤进一步加重。本试验中冷暴露加重了急性肺损伤的程度,而且提高了TLR4表达,由此可见,冷暴露加重LPS诱导的肺损伤程度与TLR信号通路密切相关。