小鼠毛乳头细胞体外分离培养方法的优化和评价*

林享玉 祝佳铭 朱 亮 王哲宁 何 晶

（同济大学医学院病理学和病理生理学系，上海 200092）

脱发是临床常见疾病，影响患者身心健康及生活质量，给患者及社会造成经济负担。而毛乳头细胞 （dermal papilla cells，DPCs） 是毛囊形态学发生的关键，被认为是促进毛发再生的重要种子细胞来源之一[1]。小鼠是毛发疾病及再生研究的重要模型和工具[2]，但传统的小鼠DPCs分离培养方法效率低、来源有限且极易老化，严重限制了毛囊再生及毛发相关疾病研究的发展[3]。因此，迫切需要建立更快速、高效的新方法。本研究在传统方法的基础上，结合精细解剖、酶消化及细胞培养体系优化，建立了分离培养小鼠DPCs的改良新方法，可获取更多数量、更好功能的DPCs，为将来毛囊发育、再生及毛发相关疾病研究提供可靠的保障。

1 材料和方法

1.1 动物与试剂

6周大雌性C57BL/6小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。主要试剂有：磷酸盐缓冲液（PBS）（Corning公司）；Ⅰ型胶原酶（Sigma公司）；胶原酶NB4（Nordmark公司）；高糖DMEM培养液、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Corning公司）；胎牛血清（FBS）、青链霉素溶液和0.05% 胰酶-EDTA（Gibco公司）；全培养基用10 mL血清、1 mL青-链霉素溶液、89 mL DMEM高糖培养基配制；碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（南京建成科技有限公司）；TRIzol（Invitrogen公司）；Prime Script RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa公司）。

1.2 DPCs体外分离培养的传统方法

DPCs分离和体外培养的传统方法参照文献报道进行[2，4]。颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡消毒5 min。眼科剪剪下两侧触须垫，置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。将触须垫真皮面朝上，在体视显微镜下用显微外科镊、剪获取完整的单根毛囊毛球部。简单剥离去除毛球周围的脂肪及结缔组织后，将收集的毛囊置于0.2%Ⅰ型胶原酶中进行消化，37℃消化2 h后，加入等体积的全培养基终止消化，800 r/min，离心3 min。弃上清液后，在体视显微镜下轻轻挑出已松散暴露的毛乳头，分散接种于培养板表面，加入少量培养液，液面稍高于皿底，于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。12 h后首次观察DPCs贴壁及迁出情况，此后每12 h观察1次，待所有的毛乳头开始迁出后，每2～3 d以完全培养基换液。

1.3 DPCs体外分离培养的改良方法

C57BL/6小鼠触须垫获取同1.2。将触须垫真皮面朝上，在体视镜下用显微剪去除毛囊毛球部位的脂肪组织，将毛球部分完全暴露，尽量沿根部剪下毛球部分，随后以显微外科镊尽最大可能剥离毛乳头周围的结缔组织及真皮鞘，采用显微弯剪将收集在培养皿中含毛乳头的毛球组织充分剪碎，置于含0.1% 胶原酶NB4的DMEM液中37℃水浴振荡消化30 min，加入等体积全培养基终止消化，2 000 r/min离心10 min，弃上清液。收集离心管底部的组织块，用含10 ng/mL bFGF的完全培养基吹打混匀后，种植于培养板，于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞及组织块贴壁迁出后，每2～3 d以完全培养基换液，注意动作轻缓，避免脱落。

1.4 DPCs的传代扩增及细胞获得数量

待2种方法获取的原代DPCs逐渐迁出，增殖并融合至90%时及时传代，加入0.05% 胰酶-EDTA 2 mL，37℃消化2 min，镜下观察细胞变圆后，去除胰酶，加入1 mL全培养基终止消化，吹打细胞至完全脱落形成单细胞悬液，补齐液体后，按1∶3的比例进行传代，继续于37℃，5% CO2的细胞培养箱中进行培养，镜下观察2种方法培养的第1至5代DPCs的生长状态。分别在原代和第1、2及5代增殖融合至90%时，用0.05%胰酶-EDTA对2种培养方法所获得细胞进行消化传代，并用血球计数板进行细胞计数。

1.5 DPCs的ALP活性鉴定

ALP是DPCs特异性标志物，可反映其毛囊诱导功能[5]。将2种方法传代获得的第2、5代DPCs分别接种于24孔板，待细胞生长至80%汇合时，弃去原培养液，PBS漂洗，按照ALP染色试剂盒说明书进行染色。将24孔板中的细胞用试剂1固定3 min；将试剂2和试剂3以20∶1的比例混合，滴加基质液数滴，覆盖已处理好的样本上，37℃避光孵育15 min左右，甩掉多余的染液；立即滴加试剂4染液染色5 min，水洗30 s，再滴加试剂5染色30 s，最后滴加试剂六复染30 s，水洗30 s，甩干，以奥林巴斯倒置显微镜进行观察。

1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DPCs中ALP mRNA表达

采用TRIzol法提取2种方法获取的第2、5代DPCs中总RNA，测定浓度与纯度后，按照Prime Script RT reagent Kit说明书方法，将各组细胞中的总RNA逆转录为cDNA，再按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书建议的反应时间与温度进行RT-PCR反应。ALP上游引物序列为5'-CAGGTCCCACAAGCCCGCAA-3'，下游引物序列为5'-CCCGGTGGTGGGCCACAAAA-3'；GAPDH上游引物序列为5'-TGCCCAGAACAT CATCCCT-3'，下游引物序列为5'-GGTCCTCAGTG TAGCCCAAG-3'。反应条件为：变性95℃，15 s；退火60℃，30 s；延伸70℃，10 s；共执行40个循环。应用公式2-ΔΔCt计算ALP基因的相对表达量。实验重复3次。

1.7 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，使用Graphpad Prism 7.0进行统计结果图的绘制，计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2种方法分离培养的原代DPCs的形态学比较

次日在镜下观察，传统方法分离培养的毛乳头周围残留毛球中的其他结构，包括周围的部分真皮鞘结构（图1A），并且只有约40%的毛乳头组织贴附于培养板底部，其余的大部分均悬浮于液体中，即使后续重新调整组织块位置也很难再次贴附于培养板底部；待种植4～5 d后可见短梭形DPCs迁出，围绕在毛乳头组织周围，至7 d左右，有大量细胞明显迁出，细胞质丰富，呈长梭形，但是残存真皮鞘也有大量细胞迁出（图1B）；而细胞迁出到完全融合需要13～14 d，并且早期迁出的细胞出现明显堆积，而组织块之间则较为稀疏。

图1 2种方法分离的原代DPCs的形态学比较，标尺=500 μm

改良方法获得的原代DPCs，次日可见经剪碎消化的毛乳头组织更松散、细碎，几乎所有的毛乳头都可以牢固并均匀的铺散于培养板底部，经换液也不会出现脱落现象，而组织块之间则贴附大量分散为单细胞的DPCs（图1C）；2～3 d时细胞可从组织块中迁出，细胞呈现长梭形，折光强，细胞质丰富，6～7 d时细胞大量迁出、增殖，原代细胞达到融合，靠近毛乳头中心位置迁出的细胞可呈现多层聚集性生长现象（图1D）。

2.2 2种方法DPCs的传代培养及形态学比较

待原代DPCs生长融合至90%时进行传代培养，2种方法的第1代DPCs均在12 h左右贴壁生长，24 h后呈现聚集性生长趋势，而48 h后聚集性生长更加明显；并且2种方法获得的DPCs形态未见明显差异，均呈现梭形或者多角形的成纤维细胞样形态（图2A，D）；在1∶3比例传代的条件下，传统方法的第1代细胞约在4 d融合至90%，改良方法则为3 d左右。

图2 2种方法传代培养的DPCs的形态学比较，标尺=100 μm

随着传代次数的增加，传统方法的第2代细胞的胞体较第1代有所增大，并以多角形为主，而聚集性生长的趋势也不明显，3 d左右可达到90%融合（图2B）；继续传代至第5代时，传统方法的DPCs细胞面积明显增大，细胞质不均匀，细胞呈现明显老化、肥大的特征，细胞活力显著下降，生长缓慢，6～7 d才可达到90%融合，且完全丧失聚集性生长的特征（图2C）。而改良方法的第2代细胞的大小、形态与第1代细胞比较变化不大，还保持着聚集性生长的趋势，细胞增殖迅速，2～3 d即可融合（图2E）；并且随着传代次数增加，到第5代细胞还能保持较好的形态，聚集性生长趋势尚未完全消失，3 d左右细胞融合（图2F）。

2.3 2种方法的DPCs细胞获得量比较

2种方法分别自4个触须垫分离并培养DPCs，经细胞计数显示，虽然传统方法的原代细胞生长时间更长，但是获得的细胞数量仅为（0.14±0.01）×106，改良方法却可获得（0.82±0.01） ×106，约是传统方法的5.85倍；另外传代后，传统方法的第1、2和5代细胞分别可获得（0.27±0.01）×106、（1.21±0.18） ×106和（14.67±0.47） ×106数量的细胞，而改良方法则为（1.74±0.02） ×106、（9.94±0.31） ×106、（203.33±20.54） ×106，分别是传统方法的6.44、8.21和13.86倍，差异均具有统计学意义（P＜0.01），结果说明改良方法可获得更多的DPCs，尤其是高代次更具优势（表1）。

表1 不同方法分离培养的DPCs细胞获得量比较（n=3，±s，×106）

表1 不同方法分离培养的DPCs细胞获得量比较（n=3，±s，×106）

**P＜0.01 vs传统方法

方法0代第1代第2代第5代传统方法0.14±0.010.27±0.011.21±0.1814.67±0.47改良方法0.82±0.01**1.74±0.02**9.94±0.31**203.33±20.54**

2.4 2种方法培养的DPCs的ALP活性的比较

ALP是DPCs特有的功能标志蛋白，其活性强度也间接反应了DPCs诱导毛发形成的能力[5]。ALP试剂盒染色，阳性反应为胞质中呈现灰黑色颗粒或块状、条状沉淀。传统方法和改良方法的2代细胞经染色后显示，改良方法的细胞ALP活性稍高于传统方法（图3A、B；E、F）；5代细胞中传统方法的DPCs基本没有ALP显色，而改良方法则仍显示明显ALP活性（图3C、D；G、H）。提示改良方法培养的DPCs的 ALP活性明显高于传统方法，尤其是在高代次细胞中。

图3 不同方法分离培养的DPCs的ALP活性鉴定，标尺=50 μm

qRT-PCR测定结果显示，与传统方法比较，改良方法培养的第2代 DPCs的ALP mRNA表达水平明显升高（P＜0.01）；随着细胞培养代次的提高，虽然2种方法的第5代DPCs中ALP mRNA表达水平均明显降低，但与传统方法相比，改良方法具有更高的ALP mRNA表达水平，与传统方法的第2代细胞持平（P＜0.01）（图4）。

图4 不同方法培养第2、5代DPCs中ALP mRNA的表达水平

3 讨论

毛囊是由表皮和真皮相互作用形成的最小器官，具有高度的自我更新能力，是唯一呈终身周期性生长的皮肤器官[6]。而DPCs是位于毛囊基底的特化的真皮成纤维样细胞，具有诱导毛囊再生的能力，是毛囊重建、传导毛发生长信号的重要结构[1～3]。因此，成功体外分离培养DPCs是开展毛囊研究的首要前提。

小鼠是研究毛发疾病最佳的模型及工具，但小鼠DPCs的分离培养其实更为困难。这是由于毛乳头解剖位置的特殊性，获取高纯度DPCs异常困难，以往多采用显微切割法从毛囊中获取完整的毛乳头，分离出 DPCs进行培养[7]。体外培养的小鼠DPCs具有特有的聚集性生长特征，可表达特异性标志ALP，移植体内可诱导毛囊形成[8]；虽然细胞具有较高纯度，但是生长周期长，获得量少，易污染，不能满足科研的需求[7]。并且随着体外培养传代次数的增加，逐渐丧失聚集性生长特征，ALP的表达也逐渐降低，同时逐渐丧失体内诱导毛发形成的能力。因此，如何获得大量并且具有良好功能的DPCs是制约毛囊研究领域发展的难题[5]。也有学者以5周龄 C57BL/6小鼠背部皮肤，在0.2%Ⅰ型胶原酶中37℃消化2 h，经过 2 次 Ficoll 密度梯度离心以获得大量DPCs，但是细胞纯度及功能仍差强人意[9]。近年来发展的解剖联合酶消化法可提高贴壁迁出率，这也是目前比较通用的传统方法，但是所获得细胞的数量及功能仍具有较大的提升空间[2，4]。

笔者前期也参照传统方法，通过显微解剖和酶消化法获得完整的单根毛囊，但这种方法获得的DPCs贴壁率差、损失率高、细胞生长速度慢，并且混杂有大量的真皮鞘细胞迁出，严重影响了DPCs纯度。因此，改良和优化分离培养DPCs方法非常必要。

在此基础上，本研究联合精细显微解剖和酶消化法进行改良。另外研究显示bFGF可促进多种细胞增殖，例如对脂肪干细胞等多种干细胞，因此被添加入多种重要细胞的培养体系中；而bFGF对DPCs的生长及功能也同样具有明显促进作用[10-11]。基于文献报道，本实验添加bFGF（10 ng/mL）以优化培养体系，从而建立了更具优势的分离培养小鼠DPCs的新方法。其优点主要体现在以下几个方面：①以显微弯剪充分剪碎毛乳头组织后用胶原酶消化，组织分解更充分，不但提高了贴壁率，而且接种密度实际上远高于传统方法，从而可显著提高DPCs获得量，缩短扩增时间；②传统方法也可以实现精准的显微解剖，但是该方法毛乳头贴壁率欠佳，反而牺牲了组织利用率和DPCs的获取数量，而加大毛乳头组织获取量势必以牺牲其纯度作为代价；与此相较，改良法具有较高的细胞及组织贴壁率，可充分体现精细解剖的优势，同时满足提高DPCs的获取数量及细胞纯度的要求；③基于文献支持，培养基中添加bFGF（10 ng/mL）显著缩短了DPCs的迁移和生长融合时间，也有利于维持DPCs的生物学功能。实验结果显示，改良方法的毛乳头几乎全部贴壁，具有更高的分离效率及细胞数量，尤其是高代次（第5代）更为显著，可维持良好的细胞形态，细胞获得量接近传统方法的14倍。另外代表DPCs毛囊诱导能力的特异性标志物ALP的表达也明显提高，尤其是高代次（第5代）的ALP的表达水平也与传统方法的低代次（第2代）的水平相当，说明改良方法有助于维持DPCs的功能。

综上所述，该改良方法提高了DPCs的获取效率和保证其特定的生物学功能，是一种更快速、高效的DPCs分离培养方法，为后续进行毛囊相关的研究提供可靠保障。