用于硼中子俘获治疗的碳硼烷多肽衍生物

韩 祎,李凤林,罗志福

中国原子能科学研究院 核技术综合研究所,北京 102413

在中国,癌症是仅次于心脏病的第二大致死原因,据统计,我国2022年452万例病患死于癌症[1],而与癌症的斗争中,尽早确诊和高效治疗至关重要。

硼中子俘获治疗(boron neutron capture therapy, BNCT)是Locher于 1936 年提出的一种二元癌症治疗方法[2],原理是10B暴露于热中子束下发生中子俘获反应10B(n,α)7Li,放出具有杀伤作用的α粒子和7Li原子,并且这些粒子的射程在7～9 μm,与一个细胞直径相近,实现一种高选择性的精准治疗[3-6]。因此只有肿瘤组织选择性对硼携带剂高摄取才能保证BNCT的治疗效果。一般认为,每个肿瘤细胞中要含109个10B原子或每克肿瘤组织中含20～50 μg10B[7],因此如何达到高硼摄取量是设计新型硼携带剂所面临的挑战性问题。

多肽能与肿瘤细胞中过度表达的受体或转运体结合,具有很高的亲和力和选择性,因此含硼多肽化合物不仅可以提高硼携带剂的载硼量,还可以增强肿瘤组织的特异性摄取量,且无免疫原性、靶向性强,是新一代硼药设计的关注热点。自20世纪60年代首次发现碳硼烷以来,研究人员一直在利用碳硼烷寻找新的高效的癌症治疗方法[8-9]。尽管有许多关于含碳硼烷多肽类化合物的设计和实验,然而迄今为止尚未有对已报道的含碳硼烷多肽衍生物进行分类和分析的文章。本文对含碳硼烷的多肽衍生物进行了总结,希望可以为新一代的新型BNCT药物研发提供思路,奠定基础。

1 碳硼烷基本结构性质

碳硼烷(C2B10H12)首次发现于20世纪60年代,根据其构型大致可以分为闭式碳硼烷、开式碳硼烷和蛛网式碳硼烷,根据碳原子和硼原子位置差异又可分为邻碳硼烷(o-carborane)、间碳硼烷(m-carborane)和对碳硼烷(p-carborane)(图1)。除了B-H键,顶点硼原子的价电子数为24,碳原子提供2个额外的电子,十三个分子轨道刚好满足二十面体结构所需,即是闭式的碳硼烷。各个顶点的原子的配位数均是6配位,有着三个中心两个电子的化学键,故而属于强缺电子结构,相邻的键会缩短增加化合物的稳定性[10]。由于碳硼烷具有高氧化性、热稳定性、疏水性和低毒性等独特的化学和物理性质,广泛应用于设计具有靶向性的药物分子当中[11]。碳硼烷分子的引入可增加药物在体内的稳定性和生物利用度,延缓体内代谢时间[12]。此外,对这些簇中的每个碳或硼原子进行选择性化学替代,可以将它们用作刚性的三维支架,在其上构建新的药物分子。

图1 碳硼烷三种构型Fig.1 Three configurations of carborane

目前关于碳硼烷药物化学的综述主要分为两类:第一类是设计靶向输送硼到细胞中用于BNCT的试剂,第二类是催化剂等其他功能性材料。根据Web of Science数据库,在过去5年的730篇关于硼中子俘获治疗的文章当中有150篇是关于碳硼烷衍生物物理和生物性质研究的文章,这为对碳硼烷衍生物深入研究与发展提供了坚实的理论基础。

2 含碳硼烷多肽衍生物发展

多肽是参与生物体代谢的必需物质,是设计生物制剂的基础,分子中天然肽片段的存在有利于增加肿瘤部位对药物的特异性摄取。含硼多肽的应用使BNCT在癌症治疗上有了重大进展[13-16]。第二代BNCT重要制剂之一是硼苯丙氨酸(boronophenylalanine, BPA)(图2),它是Snyder等[17]1958年获得的天然酪氨酸类似物(图2)。以BPA为基础合成了许多分子中含有一个硼原子的天然氨基酸的衍生物[18-25],以及基于它们的多肽衍生物[26-27],作为潜在的硼携带剂进行生物实验。在过去的50年里,碳硼烷氨基酸的制备取得了显著的进展,近年来主要关注的是含碳硼烷多肽的合成,以及含有碳硼烷片段和钆离子的化合物的合成。

图2 硼苯丙氨酸的结构[17]Fig.2 Configurations of BPA[17]

Takagaki等[28]早期合成了含有2或3个氨基酸的含碳硼烷多肽衍生物(图3(a)),实验发现该化合物显示出良好的肿瘤摄取率和低毒性,中子照射后细胞存活率下降90%。此外,Esther等[29]合成潜在硼携带剂含碳硼烷环肽衍生物(图3(b)),该环肽是生长抑素的受体易被肿瘤细胞内化。其他肿瘤细胞过表达的多肽配体也被应用于潜在硼携带剂设计合成中,以提高肿瘤细胞10B的摄取率,如整合素αvβ3、神经肽Y和表皮生长因子受体(EGFR)。碳硼烷与功能性多肽偶合大大提高了硼携带剂的靶向性以及肿瘤细胞含硼量。

图3 早期含碳硼烷多肽衍生物[29]Fig.3 Early carborane peptides derivatives[29]

碳硼烷残基的存在导致肽分子疏水性显著增加,在共轭结构中引入半乳糖残基,可以补偿这种影响,提高含碳硼烷多肽衍生物在水中的溶解度,水溶性高有益于生物体吸收、增加药效、改善药物在体内的药动学特性。Dennis等[30]以9-叔丁基硫代-间碳硼烷为基础合成了含有一个或两个脱氧半乳糖残基的间碳硼烷衍生物(图4(a)、(b)),并在其基础上合成了一组含有多达120个硼原子的神经肽Y类似物(图4(c)),生物实验证明该衍生物不仅有较好的水溶性、载硼量高,并且和人类神经肽Y1受体(human Y1 receptors, hY1R)亲和力极高。

图4 含脱氧半乳糖残基的间碳硼烷衍生物[30]Fig.4 m-carborane derivatives containing deoxygalactose residues[30]

近十年来,含碳硼烷多肽的制备引起了广泛的重视,取得了巨大的进步。碳硼烷基通常偶联到多肽末端氨基或多官能氨基酸(主要是赖氨酸)侧链中的官能团,以及将碳硼烷基硫醇加成到含有马来酰亚胺片段的多肽衍生物中。将碳硼烷残基引入治疗性肽的结构中不仅是研发新一代硼携带剂的新方向,也是改变多肽药代动力学参数以及提高药物靶向性的有力工具。

3 含碳硼烷多肽类化合物分类

3.1 神经肽Y衍生物

神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)是胰多肽家族的成员,由36个氨基酸组成,氨基酸序列为 [H-YPSKPDNPGEDAPAEDLARYYSALRHYINLITRQRY-NH2],它是脑中最丰富的神经肽之一,常被用作硼选择性进入肿瘤细胞的载体[31]。修饰NPY衍生物中的肽序列方法之一是(邻碳硼烷-9-基)巯基乙酸通过与赖氨酸残基4、18和22位的ε-氨基偶联,从而得到带有30个硼原子的[K4,18,22,F7,P34]-NPY肽5-a(图5(a))[32],另一种修饰[F7,P34]-NPY肽4、18和22位赖氨酸基团的方法是引入含有两个间碳硼烷残基的巯基乙酸合成衍生物5-b(图5(b))[33]。生物实验表明该类型多肽衍生物可以作为潜在硼携带剂被肿瘤细胞高选择性地摄取,并且在血浆中结构稳定未发现细胞毒性。

图5 含间碳硼烷神经肽Y衍生物[33]Fig.5 Neuropeptide Y derivative containing m-carborane[33]

(a)——Tyr3-奥曲肽,(b)——4-邻碳硼烷-1-基丁酸,(c)——Tyr3-奥曲肽衍生物图6 Tyr3-奥曲肽含硼衍生物[30]Fig.6 Tyr3-octreic conjugates contains boron derivatives[30]

3.2 Tyr3-奥曲肽衍生物

众所周知,大多数肿瘤细胞生长抑素受体过度表达[34]。因此靶向生长抑素受体的方法广泛应用于治疗癌症药物的开发中[34-35]。Tyr3-奥曲肽(H-D-Phe-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-OH])(图6(a))是对生长抑素受体亚型具有高亲和力的生长抑素类似物。Esther等[29]将闭合型碳硼烷与5-乙炔酸甲酯加成得到4-邻碳硼烷-1-基丁酸(图6(b)),再与生长抑制素类似物偶联得到Tyr3-奥曲肽衍生物(图6(c))。由于生长抑素在几种神经内分泌系统肿瘤的细胞表面过表达,实验发现含碳硼烷Tyr3-奥曲肽衍生物易被肿瘤细胞内化且无细胞毒性,肿瘤组织对Tyr3-奥曲肽衍生物的摄取量增加了约10倍,极大提高了肿瘤中的硼含量。

3.3 RGD多肽衍生物

整合素αvβ3在血管生成中有着重要作用,在正常组织和血管内皮细胞不表达或者低表达,但是在肿瘤新生成血管内皮细胞以及某些肿瘤细胞表面上过表达。RGD肽(Arg-Gly-Asp,RGD),1984年由Pierschbacher和Ruosluherici[36]首次报道发现,可以优先与整合素αvβ3结合,因此RGD肽及其衍生物被广泛用于肿瘤靶向治疗和诊断药物的输送[37-39]。

在RGD肽的含硼衍生物中,化合物7-a(图7(a))被认为是最有发展潜力用于BNCT的硼携带剂[40-41]。在体外和体内实验中,化合物7-a结构稳定、无细胞毒性并且明显在肿瘤细胞内大量积累,与硫基十二硼烷二钠盐(sodiumborocaptate, BSH)相比,化合物7-a在体内滞留时间更长[40]。注射化合物7-a加中子照射治疗后发现显著地抑制了SCC VII鳞状细胞癌的生长,并且在乏氧肿瘤部位硼摄取量较高[41]。Masunaga等[42]合成含邻碳硼烷偶合环肽c(RGDfK)的马来酰亚胺肽衍生物(化合物7-b,图7(b))。由于碳硼烷片段的存在,其能够与β-环糊精(βCD)形成强的主客体配合物。同时环RGD肽保留了对整合素受体的亲和力,这使得偶合物马来酰亚胺肽衍生物可以与C2C12小鼠成肌细胞的结合率更高、结合力更强。

图7 含邻碳硼烷的环肽衍生物[42]Fig.7 o-carborane-containing derivatives with cyclic peptide c(RGDfK)[42]

3.4 其他多肽衍生物

胸腺素β4(Tβ4)是一种具有多效活性的治疗肽,可促进损伤组织的愈合和再生,在肿瘤中高表达,研究发现将阴离子硼簇化合物引入胸腺素β4(Tβ4)的结构中[43],得到的偶联物在pH=6.4时稳定,在pH=8.0时易于水解,形成原生Tβ4。已经证明,含有一个或两个双钴(1,2-二羧酸)残基的Tβ4肽偶联物保留了Tβ4对心肌细胞(H9C2细胞系)的促生存活性,并且在血液循环中与白蛋白形成复合物可保护多肽免受蛋白水解降解和肾脏清除,从而延长滞留率改善其半衰期和系统疗效[44-45]。最近,Fink等[46]发现在Tβ4分子中心肌动蛋白结合域附近引入双钴(1,2-二羧酸)片段化合物(图8)可增强参与伤口愈合的细胞(如内皮细胞和成纤维细胞)的迁移活性,且对H9C2细胞系无细胞毒性,是潜在硼携带剂。

图8 胸腺素Tβ4肽含硼衍生物[46]Fig.8 Tβ4 contains boron derivatives[46]

最近,研究人员在以1-羧基间碳硼烷和1-羧基对碳硼烷为基础固相合成多肽QTAIGVGAP偶联物(图9)[47]过程中,通过建立一个有效的程序偶合碳硼烷与多肽固体载体发现1-羧基间碳硼烷与氨基的偶联优于羟基或巯基,这种效应可用于产生具有微调性质的非天然脂肽,并且反相高效液相色谱(HPLC)结果发现,碳硼烷残基的引入显著增加了多肽衍生物的疏水性,虽然无生物毒性但是靶向性不高,达不到较好的肿瘤和正常组织硼摄取量比值(T/N值),不适合做硼携带剂。但是如果用具有靶向性的多肽取缔该固相合成多肽模型,可高效提高产率的同时解决了靶向性的问题,可作为新型硼携带剂的设计方向。

图9 1-羧基间碳硼烷和1-羧基对碳硼烷与多肽QTAIGVGAP衍生物[47]Fig.9 m- and p-carborane-containing peptide QTAIGVGAP conjugates[47]

Yin等[48]使用N-(2-氯乙酰基)-(S)-碳硼酰丙氨酸氰乙酯和起始氨基酰基,合成大环肽10-a和10-b(图10)。实验证明大环肽表现出对人体表面生长因子受体(hEGFR)更高的亲和力且未表现细胞毒性,因此该类型硼肽能够选择性地聚集在hEGFR高表达的HEK293细胞表面。

图10 含硼大环肽[48]Fig.10 Boron-containing macrocyclic peptide[48]

最近基于多肽sBB2L铃蟾肽的类似物,一种选择性胃泌素释放肽受体(GRPR)激动剂,设计了一些潜在的硼携带剂[49](图11)。化合物11-a和11-b是含有80个硼原子和16个亲水性的半乳糖残基的含硼多肽衍生物,在水中具有很好的溶解度,对GRPR具有较高的亲和力。体外实验表明,化合物11-a和11-b能被高表达GRPR的PC3前列腺癌细胞选择性摄取,且不表现出内在的细胞毒性。研究发现HepG2肝细胞几乎不摄取含有16个L型半乳糖残基的偶联物11-b,而对D氨基半乳糖化合物11-a选择性大量摄取,因此研究人员认为化合物11-b是更具发展潜力的BNCT硼携带剂[49]。

图11 多肽sBB2L与半乳糖基化(间碳硼烷-9-基)巯基乙酸的衍生物[49]Fig.11 Peptide sBB2L conjugates with galactosylated(m-carboran-9-yl) mercaptoacetic acid[49]

4 总 结

迄今为止含硼的多肽衍生物的设计已经取得了许多进展,其中含碳硼烷的残基不仅被认为是一种简单的含硼取代基,而且被认为是一种在笼的不同顶点带有氨基和羧基的稳定多面体骨架,其特殊的构型拓宽了含碳硼烷多肽衍生物的应用。对碳硼烷多肽衍生物的各种生物学靶向作用研究开始于20世纪70～80年代,根据最近对神经肽Y、胸腺素和其它肽的含硼衍生物的生物学活性的研究发现,通常将闭合型碳硼烷残基引入肽的结构中会导致其理化、药代动力学和药效学特性发生相当大的变化。硼簇的加入会导致分子亲脂性显著增加,水溶性降低,因此研究人员引入单糖和多元醇残基来增加水溶性,提高生物体吸收。如何使多肽衍生物尽可能进入细胞,提高肿瘤细胞含硼量是含碳硼烷多肽衍生物发展的关键,因此新型靶向性多肽的多功能设计是将来含碳硼烷多肽衍生物的研究重点。

从20世纪70年代到现在,含碳硼烷的多肽衍生物一直有望作为新型硼携带剂应用于癌症治疗当中。碳硼烷的多肽衍生物载硼量高并且多肽对相应受体具有极高的亲和力,大大增加了硼携带剂的靶向性和肿瘤硼含量,是第三代硼携带剂的研究热点之一。本文通过对近年来已发表的含硼多肽化合物分类总结,发现含硼RGD、生长抑素、神经肽Y等多肽类衍生物作为靶向肿瘤细胞的硼携带剂具有很大的发展前景,有望为新型硼携带剂的发展带来新的突破。