生物炭不同施用量对烟草根际土壤真菌群落结构的影响

胡骞予,赵娅红,吕怡颖,邓晨宵,肜 磊,卢 超,余 磊,戴利利,齐 颖,高鹏华,蔡宪杰,闫 鼎,黄飞燕,韩天华

(1.昆明学院/云南省都市特色农业工程技术研究中心,昆明 650214;2.上海烟草集团有限责任公司,上海 200082;3.云南省烟草公司丽江市公司,云南 丽江 674100)

【研究意义】近年来,关于土壤健康和土壤质量问题逐渐成为人们关注的热点。土传病害频发导致作物大量减产,为保护土壤资源,践行可持续发展,生物炭在农业生产中得到广泛应用[1]。生物炭是生物质在缺氧或无氧条件下经高温裂解后产生的一类富含碳元素的高度羧酸酯芳香有机物[2]。因其碳质结构稳定不易被生物降解,孔隙发达具有强吸附能力[3],施入土壤可以改变土壤理化性质,继而影响土壤微生物群落结构。土壤根际微生物对环境的变化具有高敏感性[4],在一定程度上反映着土壤质量[5]。【前人研究进展】冯慧琳等[6]研究表明,施用生物炭1.2 t/hm2可提高感染青枯病烟株根际土壤的碳氮比,影响根际土壤微生物群落结构,降低厚壁菌门等致病菌丰度,维持根际土壤微生态的健康,促进烟株健康发育,降低发病率。王博等[7]研究表明,在减氮40%的条件下,施用生物炭可以提高烟株根系活力,促进根系发育,提高根际土壤微生物数量。许跃奇等[8]研究表明,有机肥与生物炭配施可以提高烟田褐土土壤细菌与真菌、放线菌和真菌的比值,改善土壤微生物群落结构。何甜甜等[9]研究表明,等碳量添加秸秆和生物炭,可以提高土壤呼吸速率及微生物生物量,生物炭与秸秆的交互效应为正值。杨敏等[10]研究表明,施用生物炭可以提高连作烤烟根际土壤微生物多样性与丰富度,改良土壤微生态环境,缓解化感自毒引起的连作障碍。【本研究切入点】目前,通过施用生物炭来改良修复植烟区土壤、调整微生物种群结构、提高烟叶质量与产量的研究较多。【拟解决的关键问题】通过高通量测序技术,深入讨论施用不同量生物炭对烟草生长发育较关键的旺长期烟株根际土壤真菌群落结构和种群功能的变化,以期为云南地区植烟土壤的保育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 处理设置与根际土壤样品采集

试验于2019年6月5日在安宁市植烟区开展,供试烟草品种为红花大金元,供试生物炭基本理化性状见表1。试验设置3种处理,在常规施肥减量10%的情况下,分别施用生物炭250 g/株(A1)、300 g/株(A2)、350 g/株(A3),以常规施肥为对照(CK)。每个处理植烟100株,3次重复,随机排列。所有处理栽培条件按照当地优质烟叶生产方式进行。

表1 供试生物质炭的基本理化性状Table 1 The basic physicochemical properties of experimental biomass charcoal

采用“S”形5点取样法采集土壤样品,在旺长期(移栽后30 d)采集每处理近烟株根部10 cm处、直径3 cm、深度15 cm的根际土壤样品约1000 g,重复3次。每份土壤样品充分混匀后分为2份,1份装入无菌袋中迅速放入干冰盒中,带回实验室放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 土壤总DNA提取及PCR扩增

烟株根际土壤样本DNA的提取参照 PowerSoil®DNA土壤基因组DNA试剂盒说明书。选用1 ng/μL DNA作为模板,ITS1基因PCR扩增选用真菌ITS基因特异性引物 ITS1F (5′-CTTGGTCATTT-AGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2R(5′-TGCGTTCTTCATC GATGC-3′)[11]。扩增程序:预变性,95 ℃ 3 min;变性,95 ℃ 3 s;退火,55 ℃ 30 s;延伸,72 ℃ 45 s;再延伸,72 ℃ 10 min,共36个循环,扩增体系为20 μL。扩增产物进行质量检测后纯化回收(参照AxyPrep DNA试剂盒方法),委托上海美吉生物进行Illumina MiSeq测序。

1.3 测序数据的处理与统计分析

剔除下机数据中的标签及引物序列,进行序列拼接得到原始数据;使用软件 Usearch(version 7.0)进行过滤,去嵌合体序列,得到有效序列;利用软件Mothur 绘制稀释度曲线(图1),判定此次测序量能否真实反映样品中真菌实际情况;同时计算文库覆盖率、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数,对根际土壤真菌群落中的物种多样性和丰富度进行评价;在 97%相似性水平上用软件 Uparse 进行 OTUs 聚类分析;利用 SILVA 数据库和软件 RDP classifier对物种进行注释,并运用 Student’sT检验对排名前10 菌属的相对丰度数据进行假设检验;使用软件Qiime 进行主成分分析;采用FUNGuild进行真菌功能预测;运用软件Excel 2017、SPSS 23.0数据处理系统进行数据处理和统计分析。

图1 稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves

2 结果与分析

2.1 土壤样品测序深度验证

通过对4组根际土壤进行Illumina MiSeq高通量测序分析,共得到有效序列18 7920条,平均覆盖率超过99%,当测序深度达到40 000时,曲线趋于平缓,说明序列数的进一步增加不会引起较多新 OTU 的出现。本次对烟株根际土壤的测序深度趋于饱和,真菌群落置信度较高,能够较为全面的反映根际土壤样品真菌群落与结构的真实情况。

2.2 真菌的OTU丰度和α多样性

由表2可知,各处理真菌群落Shannon指数表现为A3>A2>A1>CK,Simpson指数表现为A2>CK>A1>A3,ACE指数与Chao1指数均表现为A3>CK>A2>A1。Coverage值均在99.19%以上,反映出测序结果可以代表样本真实情况。由α多样性指数可以看出,A3处理真菌群落多样性及丰富度最高。

表2 不同处理根际土壤真菌α多样性Table 2 α diversity of fungi in different treatments of rhizosphere soils

2.3 OTU水平样品主成分分析

主成分分析中,2个主坐标成分是PC1和PC2,PC1主坐标成分表示尽可能最大程度地解释数据变化,PC2主坐标成分解释余下变化度中比例最大的主坐标成分,样本间距离表示样本间相似程度,距离越近说明真菌群落间差异越小。如图2所示,主成分1解释真菌群落变异的45.58%,主成分2解释变异的35.26%,两者共同解释80.84%。

图2 OTU水平样品主成分分析Fig.2 PCoA on OTU level

2.4 真菌群落结构及差异

门水平(图3-A)上,子囊菌门(Ascomycota)在各处理中均占绝对优势,其次是担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)。子囊菌门的相对丰度随着生物炭施用量的增大而逐渐降低,A1、A2、A3较CK(78.63%)分别降低2.72%、15.66%、17.50%;与子囊菌相反,担子菌门的相对丰度与生物炭的施用量呈正相关,随着生物炭施用量的增大各处理较CK(6.53%)相对丰度分别提高9.65%、75.65%、191.58%。被孢霉门在CK中的相对丰度为10.17%,A2处理较CK增加45.33%,A1、A3处理较CK分别降低34.81%、8.46%,无明显变化趋势;A1、A2、A3处理中未知分类的真菌门的相对丰度较CK(3.59%)分别增加35.93%、72.98%、54.60%;壶菌门在CK中的相对丰度为0.79%,A1处理中增加479.75%,A2、A3处理较CK分别降低58.23%、13.92%,无明显变化趋势。

图3 门和纲水平上的相对丰度Fig.3 Community abundance on phylum and class level

纲水平(图3-B)上,检测出主要的种群有粪壳菌纲(Sordariomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)和被孢霉纲(Mortierellomycetes)等。其中粪壳菌纲、散囊菌纲、座囊菌纲和锤舌菌纲为子囊菌门;伞菌纲(Agaricomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)为担子菌门;根囊壶菌纲(Rhizophlyctidomycetes)为壶菌门。在施用生物炭处理中,粪壳菌纲相对丰度表现为CK(33.35%)>A2(31.92%)>A1(29.94%)>A3(24.97%);散囊菌纲相对丰度表现为CK(25.63%)>A3(19.73%)>A1(14.99%)>A2(13.61%),表明施用生物炭处理降低了粪壳菌纲和散囊菌纲相对丰度。伞菌纲相对丰度表现为A3(13.83%)>A2(5.37%)>CK(2.38%)>A1(1.53%);银耳菌纲相对丰度表现为A2(6.03%)>A1(5.19%)>A3(4.47%)>CK(3.76%),表明施用生物炭处理提高了伞菌纲和银耳菌纲的相对丰度。被孢霉纲相对丰度表现为A2(14.52%)>CK(10.09%)>A3(9.23%)>A1(6.58%);锤舌菌纲相对丰度表现为A1(8.64%)>CK(2.96%)>A3(1.56%)>A2(0.62%),表明施用生物炭处理对被孢霉纲和根囊壶菌纲无明显的影响。

由图4可知,属水平上,主要检测出被孢霉属(Mortierella)、青霉菌属(Penicillium)和镰刀菌属(Fusarium)等合并相对丰度大于3%的菌属16类。

图4 属水平上的相对丰度Fig.4 Community abundance on genus level

青霉菌属在各处理中相对丰度表现为CK(16.65%)>A3(11.71%)>A1(8.97%)>A2(2.55%);未知分类毛壳菌科属在各处理中相对丰度表现为CK(5.37%)>A1(5.02%)>A2(1.63%)>A3(1.59%);枝孢瓶霉属在各处理中相对丰度表现为CK(3.13%)>A3(2.43%)>A1(2.35%)>A2(2.32%);表明青霉菌属、未知分类毛壳菌科属和枝孢瓶霉属生物炭处理的相对丰度均低于对照。镰刀菌属在各处理中相对丰度表现为A2(8.28%)>A1(5.94%)>A3(5.83%)>CK(5.82%);未分类的真菌菌群各属在各处理中相对丰度表现为A2(6.21%)>A3(5.55%)>A1(4.88%)>CK(3.59%);Saitozyma在各处理中相对丰度表现为A2(4.38%)>A1(3.61%)>A3(2.93%)>CK(2.28%);锥盖伞属在各处理中相对丰度表现为A3(5.01%)>A2(3.52%)>A1(0.80%)>CK(0.00);附球菌属在各处理中相对丰度表现为A2(5.15%)>A3(1.17%)>A1(0.36%)>CK(0.36%);表明镰刀菌属、未分类的真菌菌群、Saitozyma、锥盖伞属、附球菌属5个属的菌群在生物炭处理中的相对丰度均高于对照。被孢霉属在各处理中相对丰度表现为A2(14.52%)>CK(10.09%)>A3(9.23%)>A1(6.58%); 未分类的子囊菌群体各属在各处理中相对丰度表现为A1(15.03%)>A2(6.83%)>CK(5.34%)>A3(4.95%),表明这2种菌属受生物炭影响较小。

属分类水平上,根据所有样品的物种注释及丰度信息,选取根际土壤真菌丰度排名前35的物种,并按照其丰度信息绘制热图(图5),结果发现CK与A3处于同一分支,表明2组样品真菌群落结构相似。在所有样品中,锥盖伞属、未知伞菌纲属、附球菌属聚为一类,相对丰度与生物炭的施用量呈正相关。树粉孢属、淡紫紫孢菌、Rhizophlyctis受生物炭影响较大,三者在A1处理中的相对丰度最高。Paraboeremia、Phialophora在CK和A3处理中相对丰度较低,在A2处理中相对丰度较高,无明显变化。

图5 属水平真菌群落分布Fig.5 Community analysis on genus level

2.5 烟株根际土壤真菌功能预测分析

如图6所示,对4组样品利用FUNGuild进行真菌功能预测,以营养方式分类,包括病理营养型(Pathotroph)、腐生营养型(Saprotroph)和共生营养型(Symbiotroph),基于营养方式进一步补充细分,可见未定义腐生营养型(Undefined Saprotroph)、未知营养型(Unknown)、植物内生-垃圾腐生-土壤腐生-未定义腐生营养型(Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph)这3种营养型群类丰度较高。其中,未定义腐生营养型群类对应真菌有青霉菌属、木霉菌属(Trichoderma)、枝孢瓶霉属等;植物内生-垃圾腐生-土壤腐生-未定义腐生营养型群类对应的只有被孢霉属。动植物病原-植物病原-未定义腐生营养型(Animal Pathogen-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph)群类丰度在A2和A3处理中有上升趋势;动物病原-排泄物腐生菌-植物内生-体表附生-植物腐生-木质腐生营养型(Animal Pathogen-Dung Saprotroph-Endophyte-Epiphyte-Plant Saprotroph-Wood Saprotroph )群类对应毁丝霉属(Myceliophthora)、Mycothermus、毛霉菌属(Mucor)、Dichotomopilus、毛科菌属(Chaetomium)、Melanocarpus,丰度随生物炭施用量的增加而下降;植物病原营养型(Plant Pathogen)群类对应不整球壳属(Plectosphaerella)、赤霉属(Gibberella)、Curvularia、麦角菌属(Clavicep)和Aplosporella等植物病原真菌,这些种群丰度的降低表明施加生物炭可以减缓连作导致的烟草土传真菌病害。

图6 土壤真菌FUNGuild功能分类统计Fig.6 Functional classification and statistics of soil fungi by FUNGuild

3 讨 论

本研究通过不同生物炭施用量探究其对烟株根际土壤真菌群落结构的影响。结果表明,施用生物炭可以提高烟株根际土壤真菌多样性,Shannon指数随生物炭施用量的增加而上升,A1、A2、A3处理较CK分别增加1.09%、6.33%、6.55%;Chao1、ACE指数均在A3处理中最高。土壤理化性质与土壤微生物的存活息息相关,微生物依赖于土壤所供给的有机质,并且对土壤生态环境的变化具有高敏感性[9-10]。生物炭中的空隙可以提高土壤的透气性,增加土壤养分含量,为微生物提供更适宜的生存环境。研究普遍认为,微生物群落结构越复杂,总体水平越高,越有利于维持土壤生态系统的平衡。相反,微生物群落总体水平降低,丰富度及多样性指数降低,则会导致土壤生态系统抗逆性[12-13]、响应胁迫的修复能力变差[14]。本研究中A3处理烟株根际土壤真菌多样性和丰富度有所提高,在一定程度上有利于维持根际土壤微生态系统的稳定性和抗逆性。

本研究中,各处理根际土壤优势菌群为子囊菌门、担子菌门、被孢霉门,与前人研究结果相同[15-16]。其中,担子菌门与生物炭施用量呈正相关,子囊菌门与施用生物炭量呈负相关,施用生物炭后优势真菌种群结构和丰度发生改变,这一改变可能与真菌的不同生态策略有关[17]。子囊菌门大多数为腐生菌,其相对丰度与土壤含水量呈正相关,施用生物炭改变了土壤结构,透气性增强可能是造成其相对丰度下降的原因;担子菌门腐生或寄生,在潮湿的土壤中分解木质纤维素[18],且担子菌门可与植株根系共生形成菌根,提高植株对养分的吸收和利用。锥盖伞属(伞菌纲)多腐生于中性或略碱性营养丰富的土壤中[19],对土壤中的纤维素具有强分解活力。担子菌门(Saitozyma)相对丰度在施用生物炭后显著提高,该类真菌可有效修复土壤污染,促进土壤中氮、磷、钾元素的矿化[20]。粪壳菌纲和散囊菌纲是导致果树和林木煤污病的致病真菌,而粪壳菌纲下属麦角菌属的衍生物麦角酸能够导致作物减产、人和家畜中毒,此类菌群相对丰度的降低表明生物炭可以改良土壤环境,减少有害菌数量。

FUNGuild真菌功能预测表明,在所有处理中未定义腐生真菌、未知营养型、腐生营养型-共生营养型真菌相对丰度较高。植物内生-垃圾腐生-土壤腐生-未定义腐生营养型、动植物病原-植物病原-未定义营养型相对丰度变化较大。植物病原营养型中不整球壳属(Plectosphaerella)、赤霉属(Gibberella)、Curvularia、麦角菌属(Clavicep)和Aplosporella等植物病原真菌相对丰度随生物炭施用量的增加而降低。

4 结 论

施用生物炭提高了烟草根际土壤真菌的多样性,改善了土壤真菌的群落结构,表现为担子菌门相对丰度提高,子囊菌门相对丰度降低;腐生营养型和病理营养型真菌相对丰度降低,锥盖伞属、Saitozyma等有益菌相对丰度提高。表明合理施用生物炭可以改良土壤真菌群落结构,促进植烟土壤的生态系统稳定。