连作烤烟根系内次生代谢产物对烤烟品质因子的影响

潘义宏,周芳芳,黄 坤,冀新威,单双吕,张晓龙,张加研

(1.西南林业大学材料与化学工程学院,昆明 650224;2.云南五佳生物科技有限公司,昆明 650106;3.云南省烟草公司红河州公司,云南 弥勒 652300)

【研究意义】烤烟是中国重要的经济作物之一,也是农民增收的特色作物之一[1]。烤烟是忌连作作物,但由于耕地资源、交通条件和经济效益的限制,导致部分烟区轮作、休耕等耕作模式难以实现,连作现象一直存在。研究连作烤烟根系内次生代谢产物与烤烟品质间的关系,明确根系关键次生代谢产物,可为烤烟连作障碍的消减提供新思路。【前人研究进展】研究发现,烤烟连作通常会导致土壤养分失衡[2]、土壤生态环境失衡[3]、土传病害加重[4]、烤烟产量和质量下降[5],造成连作障碍。连作障碍已成为制约烟农收入和烟草产业可持续发展的重要因素。化感物质被认为是植物中的次生代谢物[6],连作导致这些物质在植物根际土壤或根系内累积,对植物造成毒害作用[7]。化感物质进入土壤主要是通过植物根系分泌,根系分泌物中含有大量具有化感活性的物质,会对植物造成影响[8]。目前,针对烤烟根际土壤化感物质对土壤的影响开展了大量研究,如对根际土壤理化性质[2]、土壤微生物[9]、土壤酶活性[10]等的影响,但对于连作烤烟根系内的次生代谢产物与烤烟品质的相关性研究关注度不够,鲜见相关报道。【本研究切入点】对连作烤烟根系内确定出的14种次生代谢产物进行因子分析,并对烤烟品质(外观质量、物理特性、常规化学成分、感官质量)进行典型相关分析。【拟解决的关键问题】探究连作条件下烤烟根系内次生代谢产物积累情况及其对烤烟品质的综合影响,明确影响烤烟品质的根系内关键次生代谢产物,以期揭示根系内关键次生代谢产物在连作障碍中所起的作用,为连作烤烟品质的改善提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验条件

试验于2019年在泸西县白水镇大孟泽村开展,供试烤烟品种为云烟87。试验地点土壤类型为红壤。于该试验地点连片地块选取烤烟连作2年、3年、4年、5年的地块。烤烟前茬为冬闲处理。烤烟统一采取漂浮育苗、膜下小苗移栽(4月18日统一移栽)的方式。

不同连作年限处理烤烟按纯氮105 kg/hm2进行施肥,其中商品有机肥占比30%,烟草专用复合肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=12∶8∶25]占比70%。烤烟移栽时,按30%有机肥和50%烟草专用复合肥进行塘施,烤烟移栽后第20天将剩下的20%烟草专用复合肥用水稀释浇施追肥,移栽后第30天浇施K2SO4(K2O≥52%)150 kg/hm2。各处理烤烟成熟后进行挂牌烘烤,烤烟其他管理措施按照泸西县烟草分公司生产技术规范统一操作。

1.2 烤烟根系样品采集及次生代谢产物分析

于烤烟封顶后第7天进行烤烟根系样品采集,每个处理地块选取长势相近且能代表该处理80%烟株长势的9株烟株(每3株根系混合成一个样品),合计36株。将烤烟根系挖出、洗净后于干燥箱中40 ℃烘干至恒重,并研磨过100目筛,混匀密封保存。

称取5.00 g样品加浓度为0.194 mg/mL的丙酸苯乙酯内标工作液1.0 mL,加入20.0 mL的混合溶液[v(二氯甲烷)∶v(乙酸乙酯)∶v(甲醇)=(1∶1∶1)],室温下浸泡24 h,于3000 r/min离心10 min,取上清液过滤至带1.0 mL尾管的浓缩瓶中,并于50 ℃抽真空浓缩至1.0 mL。再经0.22 μm有机相滤膜过滤,弃去前0.5 mL滤液,滤入进样瓶中,待上机检测。使用气质联用仪(Agilent 6890-5973N)分析样品,并采用SIM(Selected Ion Monitoring)模式质谱定性、内标法定量分析根系内14种次生代谢产物[11]。仪器分析条件参数设定参考潘义宏等[12]的方法。

1.3 初烤烟叶样品采集及品质分析

按照国标GB 2635—1992,烟叶烤后进行分级,并分别选取C3F和B2F烟叶各3.0 kg用于品质指标的检测分析。分析项目包括烟叶常规化学成分(总植物碱、钾离子、总氮、总糖、还原糖、氯离子)、外观质量(烟叶的成熟度、色度、颜色、油分、身份、组织结构)、物理特性(烟叶平衡含水率、抗张力、含梗率、厚度和叶面密度)和感官质量(烟气的香气量、香气质、杂气、灰色、燃烧性、刺激性、余味、浓度和劲头),检测方法参照李柘锦等[13]的方法进行。

1.4 数据处理

烤烟外观质量、物理特性和感官质量等品质因子均采用赋值权重指数法进行评价[14]。烤烟常规化学成分因子采用模糊数学隶属函数进行评价[13],将上述烤烟4种品质指标进行赋值权重指数法或模糊数学隶属函数评价得出综合指数后,分别与烤烟根系内次生代谢产物各因子进行典型相关分析。因子分析和典型相关分析使用SPSS 22.0软件,显著性水平P值取0.05。

2 结果与分析

2.1 烤烟根系内次生代谢产物自相关分析

连作烤烟根系内共鉴定出14种次生代谢产物,涵盖酯、酸、酰胺、醛、酚5大类,其中以酸类物质种类最多。具体包括苯甲酸、软脂酸、花生酸、亚麻酸、香草醛、邻苯二甲酸二辛酯、莨菪亭、肉豆蔻酸、棕榈酸甲酯、十七酸、硬脂酸、亚油酸、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、芥酸酰胺。

根系内14种次生代谢产物的自相关分析结果(表1)显示,莨菪亭和肉豆蔻酸、软脂酸,亚麻酸和亚油酸,花生酸和软脂酸、硬脂酸、亚麻酸、亚油酸,邻苯二甲酸二辛酯和香草醛之间呈极显著相关(r>0.8,P<0.01)。

表1 烤烟根系内次生代谢产物自相关系数Table 1 Autocorrelation coefficient of secondary metabolites in flue-cured tobacco roots

2.2 烤烟根系内次生代谢产物因子分析

巴特利特球形度检验结果显示,根系内次生代谢产物含量显著性P值远小于0.01,KMO值为0.583,可进一步做因子分析。采用主成分分析法,提取特征根大于1的因子,并采用正态化斜交法进行旋转,对烤烟根系内次生代谢产物进行因子分析。如表2所示,分析提取到的4个主要因子的累计贡献率为85.74%,对4个主成分因子的方差贡献率分别为33.46%、18.80%、17.60%和15.87%。

表2 提取因子特征值、方差贡献率、累计贡献率Table 2 Eigenvalue, variance contribution rate and cumulative contribution rate of extract factor

因子载荷能够评估根系内次生代谢产物与因子间的关联度。如表3～4所示,第一因子在变量总方差中的贡献率为33.46%,软脂酸、花生酸和莨菪亭具有较高正载荷,且三者间存在正相关。肉豆蔻酸具有较大负载荷,与第一因子呈负相关,依据该因子中物质组成,将其命名为酚酸类因子。其表达式为:F1=+0.194软脂酸-0.260肉豆蔻酸+0.142花生酸+0.130亚麻酸+0.303莨菪亭+0.0642,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)+0.007芥酸酰胺-0.037苯甲酸- 0.191棕榈酸甲酯- 0.049十七酸- 0.098邻苯二甲酸二辛酯+0.057硬脂酸+0.144亚油酸- 0.017香草醛。

表3 4个主成分因子载荷矩阵Table 3 Load matrix for four principal component factor

表4 4个主成分因子得分系数矩阵Table 4 Factor scores for four principal component factors

第二因子在变量总方差中的贡献率为18.81%,依据该因子中物质组成,将其命名为醛酯类因子。其表达式为:F2=0.136亚麻酸+0.285芥酸酰胺+0.330香草醛- 0.0532,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)- 0.109亚油酸+0.167苯甲酸- 0.400邻苯二甲酸二辛酯+0.020软脂酸+0.050棕榈酸甲酯+0.005硬脂酸- 0.080肉豆蔻酸- 0.056十七酸- 0.010花生酸- 0.033莨菪亭。

对于第三因子,其对变量总方差的贡献率为17.60%,依据该因子中物质组成,将其命名为酸酯类因子。其表达式为:F3=0.1492,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)+0.246硬脂酸- 0.231莨菪亭+0.578棕榈酸甲酯+0.326十七酸+0.204肉豆蔻酸+0.104花生酸+0.037香草醛- 0.096芥酸酰胺+0.040亚麻酸+0.030软脂酸- 0.103苯甲酸+0.0048邻苯二甲酸二辛酯- 0.032亚油酸。

最后,对于第四因子,其对变量总方差的贡献率为15.87%,依据该因子中物质组成,将其命名为酚类因子。表达式为:F4=0.133肉豆蔻酸- 0.4922,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)+0.245芥酸酰胺+0.129亚麻酸+0.369苯甲酸- 0.195棕榈酸甲酯+0.190亚油酸+0.144邻苯二甲酸二辛酯- 0.004莨菪亭- 0.077硬脂酸- 0.093香草醛+0.048十七酸- 0.096软脂酸- 0.028花生酸。

2.3 烤烟根系内次生代谢产物主成分因子与烤烟品质因子典型相关分析

以上述主成分因子F1、F2、F3和F4为自变量,烤烟常规化学成分综合指数(y1)、烤烟感官质量综合指数(y2)、烤烟外观质量综合指数(y3)和烤烟物理特性综合指数(y4)为因变量,进行典型相关分析,分析结果如表5所示。

表5 烤烟根系内次生代谢产物主成分因子与烤烟品质因子典型相关系数Table 5 Canonical correlation coefficients between principal component factor of root secondary metabolites and quality factors of flue-cured tobacco

次生代谢产物与烤烟品质因子的第1典型变量和第2典型变量均具有极显著的相关性(P<0.01),与烤烟品质因子的第3典型变量具有显著相关性(P<0.05),因此针对前3对典型变量参照表6数据进行分析。

表6 集合标准化相关系数Table 6 Correlation coefficients of set standardization

第1对典型变量中,U1=-0.448 ×F1+0.656 ×F2-0.282 ×F3+0.538 ×F4;V1=0.488 ×y1-1.092 ×y2-0.288 ×y3- 0.095 ×y4。U1为根际次生代谢产物的综合情况,V1为烘烤后的烤烟品质因子综合情况。载荷矩阵显示,第1对典型变量中,烤烟根系内次生代谢产物中的醛酯类因子和酚类因子对烤烟外观质量、感官质量和常规化学成分等品质因子贡献较大。烤烟根系内2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、邻苯二甲酸二辛酯与香草醛含量高,对提高烤烟化学成分因子具有积极作用,但对烤烟的物理特性、感官质量和外观质量等品质因子具有负面效应。

第2对典型变量中,U2=-0.627 ×F1+0.059 ×F2-0.263 ×F3-0.731 ×F4;V2=1.094 ×y1-1.421 ×y2+0.337 ×y3+0.669 ×y4。烤烟根系内次生代谢产物中的酚类因子和酚酸类因子对烤烟常规化学成分、感官质量和物理特性等品质因子贡献较大。提高烤烟根系内莨菪亭、软脂酸、花生酸含量,或减少2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚) 和肉豆蔻酸含量,可以改善烤烟感官质量,但对烤烟物理特性、外观质量和化学成分等品质因子会产生不利影响。

第3对典型变量中,U3=0.307 ×F1+0.728 ×F2+0.482 ×F3-0.379 ×F4;V3=1.421 ×y1-0.288 ×y2-0.463 ×y3- 0.575 ×y4。烤烟根系内次生代谢产物中的醛酯类因子和酸酯类因子对烤烟常规化学成分、物理特性等品质因子贡献较大。烤烟根系内香草醛、邻苯二甲酸二辛酯、棕榈酸甲酯和十七酸含量的提高,可以提高烤烟化学成分品质因子,但对烤烟物理特性和外观质量等品质因子会产生负面影响。

3 讨 论

土壤中的化感物质主要来源于植物的次生代谢产物,通过多种运输途径分泌至根际,进而影响植株的生长发育。由于研究对象不同,不同植物及不同品种根系内鉴定到的次生代谢产物也存在差异。研究发现,不同作物根系内次生代谢产物的种类不同,甜瓜根际土壤中检测到化感物质16种[15],花生根系内检测到24种次生代谢产物[16]。本研究在烤烟根系内检测到了5类14种次生代谢产物。

本研究通过因子分析将根系内14种次生代谢产物分为4类因子,分别为酚酸类因子、醛酯类因子、酸酯类因子和酚类因子,其主成分因子的方差贡献率分别为33.46%、18.81%、17.60%和15.87%。其中酚酸类因子方差贡献率远高于其他3个主成分因子。张克勤等[17]研究发现,酚酸类物质是烟草根系分泌物的主要成分,且该类物质是造成烤烟连作障碍的重要化感物质。

将根系内次生代谢产物与烤烟4个品质因子进行典型相关分析,结果表明,有2组典型相关变量关系达极显著水平(P≤ 0.01),1组典型相关变量关系达显著水平(P≤0.05),说明根系内次生代谢产物对烤烟品质因子有较大影响。烤烟根系内邻苯二甲酸二辛酯、棕榈酸甲酯、香草醛、十七酸和2.2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)含量越高,烤烟化学成分的协调性越好,但烤烟外观质量、物理特性和感官质量等因子较差。而根系内莨菪亭、软脂酸、花生酸含量越高,2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)和肉豆蔻酸的含量越低,烤烟感官质量因子越优,但其他品质因子越差。植物的部分次生代谢产物(如醇类、有机酸类和萜烯等)为烤后烤烟中的香气物质,这些物质对提高烤烟感官质量中的香气质和香气量具有重要作用[18]。已报道的烤烟中莨菪亭[19]、软脂酸[20]、花生酸[21]等对烟气感官质量具有正向影响,这可能是根系内这3种物质能提高烤烟感官质量因子的原因;另据报道,这3种植物根际分泌物在土壤中作为化感物质,对作物具有抑制作用[22-24]。本研究也说明,这3种根系内次生代谢产物的积累对烤烟外观质量、物理特性和常规化学成分等品质因子有负面影响。而香草醛、邻苯二甲酸二辛酯、2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、棕榈酸甲酯和十七酸含量对提高烤烟化学成分品质因子具有积极作用,但对烤烟其他3类品质因子质量的提高具有负面作用。一定浓度的邻苯二甲酸二辛酯会对西芹产生抑制作用[25],2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)作为主要化感物质对生菜、莴笋、小麦、玉米、高粱、油菜、决明子和半夏等8种作物均有抑制作用[26],香草醛和十七酸作为化感物质,分别会抑制胡杨和茄子的正常生长[27-28]。植物体内次生代谢产物的积累会一定程度促进植物体内相关酶活性的提高[29],而烤烟体内转化酶、淀粉还原酶、硝酸还原酶等活性的提高能分别促进烤烟蔗糖代谢、淀粉代谢以及氮代谢[30],进而促进烤烟糖、淀粉、氮、烟碱等化学成分的协调性。这有可能是这些次生代谢产物的积累能改善烤烟化学协调性的原因之一。本研究结果表明,不同连作年限(连作2 ～ 5年)烤烟均会对烤烟品质带来负面影响,烤烟综合品质较轮作对照平均下降17.57%[13],而根系内关键次生代谢产物的积累是造成烤烟品质下降的重要因素之一。结合烤烟品质评价,深入开展烤烟根系内不同次生代谢产物代谢组学和转录组学研究,可能揭示次生代谢产物对烤烟品质的影响机制。

邻苯二甲酸二辛酯、香草醛、十七酸、2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、棕榈酸甲酯、莨菪亭、软脂酸、花生酸和肉豆蔻酸这9种根系内次生代谢产物的部分物质含量增加或降低,仅仅只能改善烤烟4类品质因子中的某1类,而对其他3类品质因子均呈现抑制作用,说明总体上根系关键次生代谢产物对烤烟品质表现抑制作用,不利于提升烟农的收益和烤烟的工业可用性。因此,如何有效降低根内有害次生代谢产物[如:香草醛、2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、邻苯二甲酸二辛酯等]积累,或促进对烤烟感官质量有利的根部次生代谢产物(如:莨菪亭、软脂酸、花生酸等)向地上部叶片中运输,可能是解决烤烟连作障碍的另一途径,为缓解烤烟连作障碍提供技术思路。

4 结 论

连作烤烟根系内共检测鉴定到14种主要次生代谢产物。通过因子分析提取4个主成分因子,分别是酚酸类因子、醛酯类因子、酸酯类因子和酚类因子,变量总方差占比分别为33.46%、18.81%、17.60%和15.87%。4个主成分因子与烤烟品质因子典型相关分析显示,烤烟根系内邻苯二甲酸二辛酯、棕榈酸甲酯、香草醛、十七酸和2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)含量对改善烤烟化学成分的协调性具有促进作用,但不利于烤烟其他品质的提升。而根系内莨菪亭、软脂酸、花生酸含量越高,2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)和肉豆蔻酸含量越少,对烤烟感官质量因子有改善作用,但对其他品质因子有负面影响。