基于网络药理学和分子对接探讨黄芪治疗胶质瘤的有效成分和作用机制

罗明明，张 晖，郭方曦，贾利娜，纪玉龙，王 琪

（1. 江西省肿瘤医院，江西 南昌 330006；2. 赣南医学院公共卫生与健康管理学院，江西 赣州 341000；3. 江西省卫生健康事业发展中心，江西 南昌 330006）

胶质瘤（Glioma）是颅内肿瘤中最常见的恶性肿瘤，发病率占颅内肿瘤首位，预后差、存活率低，目前治疗胶质瘤的主要手段是手术治疗、化疗和放疗[1］，虽能在一定程度上延长患者生存时间，但由于胶质瘤的耐药性和易转移性，患者预后依然较差，中位生存时间不足15 个月[2］。不仅如此，放化疗等治疗手段还会给患者带来一系列不良反应，影响患者生存质量。因此，迫切需要新的治疗手段和方法。近年来，中医领域对胶质瘤的研究逐渐加深。中医认为脑为髓之海，髓为肾精所化，故脑主要依赖肾之精血濡养，肾精血不足，头脑失其所养，日久形成脑部肿瘤[3］。中医治疗胶质瘤的方法包括中药、针灸、推拿等，而以中药治疗为主。中药具有活性成分多、可以增强患者免疫功能及不良反应小等特点，已越来越多地被用于肿瘤的辅助治疗中[4］。

在传统的中药中，黄芪具有悠久的药用历史，所含活性成分多，且具有补气、止汗解毒、消肿、促进排尿的作用[5］，在临床中应用广泛。异鼠李素作为黄芪活性成分之一，广泛存在于自然界中，表现出抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化应激以及内皮细胞保护等方面的功效[6］；而槲皮素作为黄芪中所富含的另一种成分，在多种中草药中含量也很丰富，它是一种天然的小分子黄酮类化合物，具有包括抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂在内的多种生物活性和药理作用[7-9］。尽管黄芪含有多种成分，但目前关于这些成分对胶质瘤的影响以及其作用机制仍不够清楚，需要进一步研究。

近年来有学者[10］从网络药理学的角度提出了明确中药与疾病有关的有效成分及可能机制的概念与方法：“网络靶标”。作为一种新兴方法，网络药理学为探讨中药治疗疾病的成分及其可能作用机制提供了新思路[11］。有研究[12-13］表明，运用分子对接、网络药理学等方法能够有效预测中药的活性成分、作用靶点及作用机制，这为节约药物开发成本提供了新思路，同时也为研究中医药的成分和机制提供了新途径。

目前关于黄芪的活性成分治疗胶质瘤的研究较少，相应的机制探讨也较为缺乏。本研究拟通过网络药理学等技术来预测黄芪治疗胶质瘤的潜在作用靶点及作用机制，从中药学角度为胶质瘤的治疗提供新的思路和方向。

1 材料与方法

通过筛选黄芪的化学成分及其作用靶点，确定胶质瘤的相关靶点以获取黄芪成分与胶质瘤作用的靶标基因，在此基础上进行网络可视化及PPI 网络构建、GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，明确靶标基因及其功能和作用机制，最后通过分子对接可视化黄芪成分与基因互作的过程。研究过程及其介绍如表1所示，研究流程图如图1所示。

图1 黄芪治疗胶质瘤的有效成分及作用机制的技术路线图

2 结果与分析

2.1 活性成分筛选在TCMSP 数据库中检索黄芪，按口服生物利用度OB≥30%和药物相似性DL≥0.18 作为筛选标准，共获得20 种化合物，包括槲皮素、山柰酚等活性成分（图2），同时构建黄芪活性成分数据集，以便后续分析。

图2 经筛选获得的20个黄芪活性成分

2.2 黄芪活性成分作用与胶质瘤共同靶点筛选通过联合两个数据库（GeneCards 数据库、OMIM数据库）以关键词“Glioma”进行检索，最终得到5 306 个胶质瘤候选靶点基因。其中在GeneCards数据库中检索得到5 289 个与胶质瘤相关的基因，在OMIM 数据库补充基因17 个。在获得黄芪活性成分的基础上，从TCMSP 平台检索获得黄芪活性成分对应的靶点基因180个。将黄芪活性成分对应的180 个靶点基因与胶质瘤的5 306 个靶点基因取交集，共获得137个共同靶点（图3）。

图3 黄芪活性成分与胶质瘤交集靶点韦恩图

2.3 成分—药物靶点网络构建通过R x64 4.1.2软件将20 种有效成分与137 个成分靶点按属性进行编排后，导入Cytoscape v3.9.1软件构建黄芪活性成分—靶点网络图（图4），黄芪20 个活性成分中有7个化合物未参与网络构建，因此图中并未显示。

图4 黄芪活性成分—预测靶点网络

图中共有150 个节点，其中137 个基因节点，13个黄芪活性成分节点。图中可见一个靶点可对应多种药物活性成分，一种药物活性成分也对应多个靶点。以Degree 值大小设置节点面积大小，并进行排列筛选获得排名前5 的活性成分分别为quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、7-O-methylisomucronulatol（7-O-甲基异丙醇胺）、isorhamnetin（异鼠李素）、formononetin（芒柄花黄素），推测这些化合物可能是黄芪治疗胶质瘤的主要活性成分。

2.4 靶点相互作用PPI 网络将得到的137 个交集靶点导入STRING平台构建PPI网络。所得PPI网络共有137个节点，481条边，平均节点数为7.02，并下载导出TSV格式文件，导入Cytoscape v3.9.1软件进行网络拓扑分析。选择Degree≥12、Betweenness≥202.560 25 和Closeness≥0.418 43[16］的靶点作为关键靶点，共获得16 个关键靶点：IL-2、AR、PRKCA、STAT1、HIF1A、RB1、MYC、MAPK8、IL-6、ESR1、MAPK14、FOS、AKT1、RELA、MAPK1、JUN。靶点信息见表2。黄芪治疗胶质瘤的PPI 网络及关键靶点筛选过程见图5。构建“黄芪—化学成分—关键靶基因—胶质瘤”网络图（图6）。而Mairin、FA 等5 个化学成分的相关靶点与这16个关键靶点无交集，已 删除，故未在图中显示。

图5 黄芪治疗胶质瘤的PPI网络及关键靶点筛选

图6 黄芪—化学成分—关键靶基因—胶质瘤网络图

表2 关键靶点信息

2.5 黄芪对胶质瘤作用靶点的生物信息学分析

2.5.1 GO 功能富集分析经过对交集靶点基因进行功能富集分析，共确定了2 326 个生物学过程（BP）、92 种细胞组分（CC）及204 种分子功能（MF）。根据P值从小到大筛选出排名前12 的生物学过程，见表3，并绘制柱状图（图7）。

图7 GO富集分析柱状图

表3 GO功能富集分析生物学过程

2.5.2 KEGG 通路分析为了探索黄芪治疗胶质瘤的信号通路机制，进行KEGG 通路分析。通过微生信平台对交集靶点基因进行信号通路的KEGG富集分析，共有172 条信号通路差异有统计学意义（P≤0.05）。其中，与胶质瘤关系密切的前20 条通路如图8、表4 所示。经KEGG 通路分析发现，黄芪改善胶质瘤主要作用于糖尿病并发症中的AGERAGE 信号通路、脂质和动脉粥样硬化通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路等，共同调节和互相协调可能为黄芪抗胶质瘤的作用机制。

图8 KEGG通路富集分析气泡图

表4 黄芪治疗胶质瘤关键靶点参与的通路信息

2.5.3 分子对接基于网络药理学的结果，筛选出排名前5 的黄芪活性成分，分别是槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异丙醇胺、异鼠李素、芒柄花黄素，并与排名前5 的蛋白AR（PDB ID：1E3G）、MAPK14（PDB ID：6ZWP）、AKT1（PDB ID：5WBL）、RELA（PDB ID：6POZ）、JUN（PDB ID：6OSN）分别进行分子对接，分子对接结果显示，黄芪的活性成分与潜在靶点有较好的结合活性。小分子与蛋白质对接的结合能热图见图9，其中槲皮素与MAPK14（-9.50 KJ·mol-1）、槲 皮 素与JUN（-8.60 KJ·mol-1）、山 柰酚 与JUN（- 8.80 KJ·mol-1）、芒 柄 花 黄 素 与MAPK14（-8.00 KJ·mol-1）和AR（-8.00 KJ·mol-1）、异鼠李素与AR（-8.60 KJ·mol-1）结合较强。以槲皮素与MAPK14（-9.50 KJ·mol-1）、槲 皮 素 与JUN（-8.60 KJ·mol-1）、山柰酚与JUN（-8.80 KJ·mol-1）、异鼠李素与AR（-8.60 KJ·mol-1）为例，采用Pymol软件查看小分子与蛋白质的对接模式图（图10）。

图9 小分子与蛋白质对接结合能热图

图10 活性成分与靶点基因的分子对接模式

3 讨论

本研究所介绍的黄芪活性成分与传统中药学中的“有效成分”概念存在一定的出入。传统的“有效成分”指的是黄芪中具有药理学活性的化学成分；而本研究中的“活性成分”则选择更严格的标准，通过采用OB/DL 两个指标，结合“黄芪活性成分—预测靶点网络”中得出的关键化学成分来作为黄芪的活性成分。黄芪中的活性成分槲皮素、异鼠李素、山柰酚等均有较好的抗肿瘤作用。槲皮素是一种天然的小分子黄酮类化合物，在多种中草药中含量丰富，其化学名为3，3′，4′,5，7-五羟基黄酮，分子式为C15H10O17，具有多种生物活性和药理作用[7-8］。其抗癌机制主要包括以下内容：调节信号通路、抑制增殖和侵袭转移、逆转耐药性、增强化疗敏感性、诱导凋亡和自噬等[17］。槲皮素对肿瘤细胞增殖具有较强的抑制作用，已应用于多种肿瘤治疗。体外实验发现，槲皮素可通过血脑屏障，阻断人胶质瘤细胞的DNA 合成而使其细胞周期停滞在G2/M 期，进而抑制肿瘤细胞侵袭和迁移[18］。异鼠李素即3，5，7-三羟基-2-（4-羟基-3-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮，是一种广泛存在于植物中的类黄酮，是槲皮素的直接代谢物，具有抗炎、抗氧化应激、保护内皮细胞、抗肿瘤等作用[6］。有研究[19］表明，异鼠李素可以抑制多种肿瘤细胞生长，其作用机制可能涉及抑制细胞增殖途径并诱导细胞凋亡。异鼠李素可能通过调控Ras/MAPK信号通路实现细胞的S期阻滞，在这一过程中Ras/丝裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases， MAPK）信号通路下游级联蛋白丝裂原激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase， MEK）和细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）的磷酸化水平明显降低，而Ras蛋白的表达水平无变化，说明异鼠李素可能通过调控Ras/MAPK 信号通路来实现细胞的S 期阻滞、减少处于G2/M 期和G0/G1期的细胞数量抑制肿瘤细胞增殖[20］。山柰酚是一种多羟基黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中。研究[21-22］表明，山柰酚具有多种药理学活性，包括抗癌、抗氧化和抗炎等活性。有文献[23］表明，山柰酚能够抑制MAPK 相关的ERK 和p38 信号通路。此外，蔡美云等[24］研究发现，经6-羟多巴胺干预的PC12 细胞炎症水平升高，在加入了山柰酚处理后，炎症相关蛋白表达明显下调，同时磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（pp38 MAPK）表达升高，进一步实验发现p38MAPK 可降低炎性相关蛋白的表达水平，表明山柰酚可能是通过p38 MAPK 信号通路发挥抗炎作用。HONG J等[25］发现山柰酚能显著抑制血红素加氧酶-1 基因的表达，降低其对PC12 细胞的氧化损伤作用，并且同样也发现山柰酚通过MAPK等信号通路增强细胞的抗氧化功能。

PPI 网络分析结果筛选出16 个关键靶点，包括IL-2、AR、PRKCA、STAT1、HIF1A、RB1、MYC、MAPK8、IL-6、ESR1、MAPK14、FOS、AKT1、RELA、MAPK1、JUN，尤其是JUN（AP-1转录因子）、AR（雄激素受体抗体）、MAPK14（MAP 激酶家族K14）、RELA（转录因子NF-κB），可能是核心靶点。相关研究[26］表明，JUN基因编码的蛋白质转录因子AP-1 在肿瘤形成、发展中发挥作用，AP-1 家族的JUN 蛋白能影响基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、CD44 等肿瘤相关因子。AP-1 调控胶质瘤的作用可能是转录因子AP-1 的下调，使得MMP-2 等减少表达，促进胶质瘤的进展。AR 是雄激素受体的一种，能作为激素诱导型DNA 结合转录因子发挥生物学功能。近年来研究[27］发现，AR 在胶质瘤组织中表达水平升高，这提示AR 与胶质瘤产生发展存在关联。另有研究[28］证实，通过下调胶质瘤细胞中AR 的表达水平可以减弱胶质瘤的增殖、侵袭能力，同时促进肿瘤细胞的凋亡，进一步的实验证实，AR 通过基因和非基因转录激活PI3K/Akt 信号通路参与细胞增殖进而影响肿瘤的进展。有研究[29］发现，AR 还参与了原癌基因和抑癌基因的调节过程：通过调控下游靶基因影响细胞的增殖与凋亡。MAPK14 属于MAPK 家族成员之一，多种恶性肿瘤中均发现MAPK 出现异常活化。张静等[30］对人胶质瘤组织进行的免疫组化分析显示，MAPK 及p-MAPK 阳性表达的区域面积百分率明显高于正常脑组织，表明MAPK 异常活化可能与神经胶质瘤的形成和发展有关。RELA，即转录因子NF-κB，是1986 年由SEN R 等[31］在成熟的B 淋巴细胞中所提取出的一种对细胞信号通路起调控作用的重要转录因子。研究发现，NF-κB 不仅可以对免疫应答、炎症反应起调控作用，同时还参与细胞分化、细胞周期调控、细胞凋亡等反应[32-33］。近年来有研究[34］发现，在多种恶性肿瘤中均发现有NF-κB 持续活化的现象。NF-κB 可以促进IL-2 受体、T 细胞受体α、β 链的表达，进而介导IL-2 毒性损伤和T细胞与内皮细胞的黏附。这可能会导致内皮细胞受损，从而为肿瘤的转移创造了条件[35］。核心靶点JUN、AR、MAPK14、RELA均有调控胶质瘤的功能，表明黄芪治疗胶质瘤的作用机制可能与上述功能有关。

本研究将黄芪关键活性成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异丙醇胺、异鼠李素、芒柄花黄素分别和5个核心靶点进行分子对接，结合关联性热图、分子对接模式图分析，所对接的所有靶点分子对接的结合能均＜-5 KJ·mol-1，其中槲皮素与MAPK14 对接的结合能为-9.50 KJ·mol-1，为所有对接中的最低值，说明黄芪中有效成分可以较好地结合在关键靶点上，验证了基于生物网络辨识关键成分的可靠性。

为探索黄芪治疗胶质瘤的作用机制，本研究进一步采用GO 分析和KEGG 通路分析进行探讨。GO分析结果显示，黄芪可能通过参与脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、细胞应激、细菌源分子、抗氧化以及药物反应等发挥治疗胶质瘤的作用。LPS反应是胶质瘤发生的根本机制之一。有研究[36］表明，LPS除通过神经炎性机制间接损伤神经元外，降低GluTs 功能，抑制胶质细胞对Glu 的摄取，也是其损伤神经元的作用机制之一。LPS是革兰阴性菌的代谢产物[37］，黄芪或其活性成分多以口服摄入为主，因此黄芪是否可通过影响肠道微生物的稳态，干扰脂多糖途径影响胶质瘤的发生发展，值得深入探究。此外，NF-κB通路在炎性细胞因子（如IL-6、IL-8）的产生中发挥重要作用，在肿瘤微环境调控中发挥重要作用[32-33］。研究[38］表明，IL-6 可诱导胶质母细胞瘤中的NF-κB，引起STAT3的激活，增强肿瘤侵袭性。KEGG 通路富集分析提示，胶质瘤涉及的疾病较为复杂，主要包括糖尿病的并发症、脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎等，同时涉及多种肿瘤，如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌和小细胞肺癌等，说明胶质瘤发病机制复杂，涉及疾病广泛。本研究结果为黄芪在治疗胶质瘤过程中的作用机制提供了较为清晰的科学依据，为黄芪的复方研发提供了思路。

本研究还存在一定局限性：本研究基于现有数据库进行探讨，由于数据库数据在不断更新，不断用新的数据进行更新分析对于保持结果的相关性至关重要；此外，网络药理学基于系统靶点分析初步探讨了中药成分的可能作用，这些推断仍有待于临床试验、动物实验进行验证。

4 结论

基于网络药理学方法最终筛选出黄芪的5种活性成分：槲皮素、山柰酚、异鼠李素、7-O-甲基异丙醇胺及芒柄花黄素，作用于5 个核心靶点JUN、MAPK14、RELA、AR、ESR1，黄芪治疗胶质瘤的作用机制可能与脂多糖反应、AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用、脂质和动脉粥样硬化等有关。