厚冰冻切片尼氏染色方法研究

金一丹,沈俊媛,解子璇,潘永良,刘婉茹

(湖州师范学院 医学院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

脑区划分的精准程度会影响细胞和神经化学物质在不同脑区的分布统计结果,进而影响脑科学整体实验结论[1].尼氏染色法使用碱性染料(焦油紫、甲粉紫、硫堇等)使神经元胞体内的尼氏小体着色[2],染色后,脑区边界清晰,组织结构明显,因此常被用于薄组织切片的二维形态学分析[3],是实现脑区划分的重要方法.相较薄切片而言,百微米级的厚脑切片包含的细胞更多,且神经元的形态更完整[4],因此更适于一些神经化学物质的分析和细胞整体形态学结构的观察.虽然已有研究详细介绍了几微米到五十微米厚度薄切片的尼氏染色方法[5-6],但缺乏对更厚切片尼氏染色方法的相关报道,由此导致在对厚切片区域划分时,研究者需参照连续薄切片的染色图像,对解剖结构和相对位置进行人工重建.然而,这种方法易存在主观差异和产生形态学干扰[7-8],极大影响了实验结果的准确性.因此本实验以长爪沙鼠200 μm冰冻脑切片为研究对象,在薄切片尼氏染色方法的基础上,对厚冰冻切片染色过程中可能出现冰晶样空洞、脱片、染色不均等问题的步骤加以改良,以探讨出一套适用于厚冰冻切片的尼氏染色方法.

1 材 料

1.1 实验动物

雄性长爪沙鼠购自浙江省实验动物中心,实验期间饲养于温度(22±2)℃、相对湿度(50±5)%的环境中.本研究对实验动物的所有操作均遵循湖州师范学院实验动物使用规范,并在处理过程中尽量减少动物的痛苦.

1.2 实验器材与试剂

防脱载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)、Leica CM1850 冰冻切片机(德国雷卡公司)、染色架(FJ026,上海碧云天生物技术有限公司)、LZJ-6EL型手术显微镜(镇江中天光学仪器有限责任公司)、Zeiss Axio Scope.A1显微镜(北京盛鸿程科技有限公司)、立式缸等;4%多聚甲醛(41533,国药集团化学试剂有限公司)、TritonX-100(14600102,西陇化工股份有限公司)、PBS溶液(C0221A,上海碧云天生物技术有限公司)、尼氏(Nissl)染色液(C0117,上海碧云天生物技术有限公司)、酒精、蒸馏水等.

2 研究方法

2.1 厚切片制备

长爪沙鼠按8 mg/100 g的标准经腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉后立即断头取脑,将脑组织置于干冰中速冻至表面变白后存于-80 ℃冰箱中,以待备用.冰冻切片机温度控制在-10～-12 ℃,切片前将鼠脑移至冰冻切片机内复温至少20 min.行200 μm冠状面切片,取置于室温下的防脱载玻片与处于冰冻切片机操作环境温度(-10～-12℃)下的脑区冠状切片,其温差近35 ℃,这可使切片自然黏附于防脱载玻片上.

2.2 染色步骤

切片经40～50 ℃烘干2～3 h,再经室温完全风干后,放入4%多聚甲醛溶液中固定,置于4 ℃冰箱过夜;从4%多聚甲醛固定液中取出,放入铝制染色架内,通过立式缸内蒸馏水浸泡玻片1 min的洗涤方法,洗去多聚甲醛;将切片置于含0.5% TritonX-100的PBS溶液中破膜2 h,再在立式缸内用蒸馏水浸泡玻片1 min,洗去破膜液;室温下焦油紫染色30 min,将切片浸入蒸馏水2次,再依次浸入浓度分别为 50%、75%、85%、95%、100%的酒精中进行梯度脱水,每种溶液的脱水时间均为1 min,共7 min.以上操作皆于立式缸内完成.中性树胶封片、贴标签,晾干后及时在显微镜下观察,并拍摄成像.

3 结 果

采用Zeiss Axio Scope.A1显微镜,在50倍和200倍下观察长爪沙鼠厚冰冻脑切片,结果见图1.由图1可见,尼氏小体着色明显,呈深蓝色;背景着色均匀,呈淡蓝色;无冰晶空洞,染色对比度强(图1).

手术显微镜所成的切片图像见图2.由图2可见,脑区界限清晰,皮层、海马、脑室等组织结构明显,切片形态基本完整,无松散、皱褶、脱片现象.

4 讨 论

在神经科学领域,用百微米级的厚切片开展特定脑区神经元形态学观察和基因表达分布等研究,越来越受到人们的重视.虽然尼氏染色在几微米至数十微米厚度的薄切片染色中较为成熟,但在厚切片中报道较少.以往研究发现,厚切片染色易出现空洞、脱片、染色效果不佳等问题.因此,本研究在薄切片尼氏染色方法的基础上,对厚切片染色过程中出现问题的步骤进行改良,以建立一套适用于厚切片尼氏染色的方法.

在脑组织冷冻切片染色中,切片最好稍晾干后再固定,而不能立即固定[9-10].因为脑组织内有多个微囊,冰冻切片立即固定染色会出现类似冰晶的空洞,而用电热吹风正吹后或室温晾干后固定染色则无空洞形成[11-12].冯家成等用电热吹风正吹切片或将切片置于室温晾干2 min以上后固定,可使微囊消失弥合,且无空洞产生[13].因冯家成等处理的是4～6 μm冰冻切片,所以本研究根据切片厚度及烘干温度,调整了烘片时间的长短,染色效果理想.实验证明,烘片时间与切片厚度成正比,与烘片温度成反比.但要注意的是:温度不可过高,否则会破坏细胞的形态结构[14];烘片时间也不宜过长,在切片较为透明时即可停止烘片,否则会出现染色过程中的“灰染”现象.

固定和染色的时间长短常影响切片的染色效果.本方法将200 μm切片置于4%多聚甲醛溶液中固定超12 h,切片固定充分,染色均匀,细胞着色清晰.梁艳清等认为,4%多聚甲醛较温和,可维持细胞形态,适合作为新鲜组织冰冻切片的固定液[15].但其固定速度慢,通常需要较长的固定时间[16],而且厚切片的中间组织不易彻底固定,染色后中间细胞着色模糊,染色不均[17].延长固定时间可使核浆着色后的光学差异更为显著,颜色更加鲜明,便于观察[18].这与本研究的染色结果一致.本文采用焦油紫染液染色30 min左右,染色结果清晰、对比度强.探索染色时间时,在尼氏染色第一遍蒸馏水洗涤后,直接在镜下观察切片的染色程度.若染色较浅、核质清晰度一般,可复染并适当延长染色时间;若染色过深、核浆显色对比度弱,可适当延长不同梯度酒精的分色时间.

防脱片在染色过程中十分重要,实验操作一般要做到以下几点:①固定前充分烘片,使切片与载玻片贴合得更紧密,以降低脱片的概率;②使用染色架要以立式缸浸泡玻片的洗涤方法取代流水直接冲洗,以有效减少因剧烈洗涤而导致的脱片;③尼氏染色切片需经梯度脱水和二甲苯透明.但厚切片经二甲苯透明后,易发脆变硬,进而出现破碎、松散、脱片.因此,本文未采用二甲苯透明,而是用酒精脱水后直接封片,在保证切片质量的同时,还可避免与有毒试剂接触,且更为安全.

本研究改良了厚切片尼氏染色过程中易产生的冰晶样空洞、脱片、染色效果不佳等问题,获得了良好的染色效果,能较为清晰地展现出厚切片的组织形态,进一步提高了尼氏染色技术在厚切片中的应用价值.这种适用于厚切片尼氏染色的方法也可为多种厚度、多种组织切片类型的尼氏染色提供参考.