粮食中黄曲霉毒素的产生机制和检测方法探究

邹邵华

（长春市粮油卫生检验监测站，长春 130103）

根据联合国粮农组织统计，黄曲霉是全球谷物最主要的污染真菌之一[1]。黄曲霉毒素（AFT）主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类真菌毒素，主要有B1、B2、G1、G2等羟基化代谢产物[2]。其中黄曲霉毒素是黄曲霉产生的最主要的毒素之一，同时具有高致癌性、高毒性，主要存在于玉米、花生等富含脂肪酸的粮食和油料作物中[3]。因此，黄曲霉毒素的防治一直是粮食安全的重要课题。阐述已知的黄曲霉毒素的种类、产生机制，总结了黄曲霉毒素合理的防治手段以及现有的检测方法，为进一步优化黄曲霉毒素的检测方法，更好保障粮食安全，提供理论基础。

1 黄曲霉毒素的种类

粮食中常见的目前已发现鉴定的黄曲霉毒素多达20 余种，包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、黄曲霉毒素M1（AFM1）、黄曲霉毒素B2a（AFB2a）、黄曲霉毒素M2（AFM2）、黄曲霉毒素P1（AFP1）、黄曲霉毒素H1、黄曲霉素GM、黄曲霉毒醇等[4]。黄曲霉毒素B1和G1的二氢呋喃环末端存在双键，因此导致其毒性剧大，微少量便能引发生物罹患癌症[5]。其中，黄曲霉毒素B1是最常见的一种，也是毒性最强的一种。

2 黄曲霉毒素的产生机制

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉属真菌产生的毒素，可存在于各种粮食中，包括玉米、小麦、大米、大豆等。黄曲霉毒素的产生是一个复杂的过程，受到多种因素的影响，其产生机制主要包括以下几个方面。

黄曲霉菌的代谢：黄曲霉菌对高含油量的农作物，如花生、坚果、玉米和棉籽等危害较大。黄曲霉菌和寄生曲霉在代谢过程中会产生多种代谢产物，其中包括污染农产品和食品毒性最大、致癌力最强的一类真菌毒素即黄曲霉毒素[6]。这些代谢产物会随着真菌的生长而积累，最终导致毒素含量的增加。

环境因素：黄曲霉毒素的产生与环境因素密切相关，如光照、温度、水活度、碳氮源、pH 值及氧化胁迫等。一般来说，黄曲霉毒素的产生需要适宜的温度和湿度，而特殊波长的光线、较高的pH 值、较低的活性氧水平则会抑制其产生[3]。

真菌感染：黄曲霉菌在粮食中生长时，会通过侵染粮食的表面或内部组织，引起粮食的腐烂和变质。这种真菌感染是黄曲霉毒素产生的前提条件。

粮食的品种和质量：不同品种的粮食对黄曲霉菌的感染和毒素产生的敏感程度不同，同时粮食的质量也会影响黄曲霉毒素的产生。例如，受到损伤或污染的粮食更容易受到黄曲霉菌感染和毒素污染。

3 黄曲霉毒素的危害

黄曲霉毒素对人和动物健康的危害与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关，其通过干扰DNA 和RNA 的合成，进而干扰蛋白质的合成，从而导致人和动物全身性的损害。具体表现危害包括：①致癌，黄曲霉毒素可以导致肝癌、结肠癌等多种癌症，长期暴露于黄曲霉毒素可能会增加罹患癌症风险；②肝脏损伤，黄曲霉毒素会对肝脏造成损伤，导致肝细胞坏死和肝功能障碍[7]；③神经毒性，黄曲霉毒素会对人体神经系统造成损害，导致头痛、头晕、恶心及呕吐等症状；④损害免疫系统，黄曲霉毒素会削弱免疫系统，使人体对病毒和细菌抵抗力下降，更易感染。

4 黄曲霉毒素的防治手段

人们应该避免食用发霉的粮食，特别是高风险的食品和饲料，如玉米、花生、大米及小麦等。同时，要注意食品和饲料的储存和保鲜，避免潮湿、高温和长时间存放。

第一，严格控制食品加工过程中的温度、湿度和pH 值等因素，避免黄曲霉的生长和繁殖。

第二，加强食品卫生管理，保持粮油食品加工和储存环境的清洁卫生，防止黄曲霉的污染。

第三，可采取物理（吸附剂、光、辐射等）或化学方法（氨气熏蒸法、碱处理、臭氧降解、提取挥发油等）进行防控[8]。

第四，在食品生产和加工过程中，可添加一些抗菌剂或抗氧化剂等添加剂，以增强食品的抗菌和抗氧化能力，从而减少黄曲霉毒素的产生。

第五，加强食品质量检测和监管，及时发现和处理黄曲霉毒素污染的食品，保障公众健康。

5 黄曲霉毒素的检测方法

依据真菌毒素的限量标准GB 2761—2017 《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》，我国主要对毒性较强的黄曲霉毒素B1和M1进行了限量要求，其中黄曲霉毒素M1仅对乳和乳制品及婴幼儿配方食品等特殊膳食食品进行了限量指标要求，均为0.5μg/kg，黄曲霉毒素B1对6 大类食品进行了限量指标要求，其中特殊膳食食品限值最低，为0.5 μg/kg，其它类别的限值在5～20 μg/kg[9]。目前，国内外对黄曲霉毒素的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附测定法、光学显微镜法、快速检测卡法。

5.1 高效液相色谱法[10]

该方法利用高效液相色谱仪分离样品中的黄曲霉毒素，并通过检测其荧光光谱来定量。高效液相色谱法（HPLC）是国内外使用较多的检测黄曲霉毒素的方法，具体步骤如下：

样品制备：取适量待测样品，加入适量的甲醇或乙醇进行提取，待提取液离心后取上清液，过滤后进行下一步操作。

样品预处理：将上清液过免疫亲和柱进行预处理，去除杂质和干扰物质，使样品净化、富集后便于检测。

样品分离：将样品注入高效液相色谱仪中，通过高效液相色谱柱进行分离，分离出黄曲霉毒素和其他成分。

检测和定量：通过荧光检测器检测黄曲霉毒素的浓度，根据标准曲线进行定量分析。

数据分析：将得到的数据进行处理和分析，得出样品中黄曲霉毒素的含量，判断是否符合相关标准。

在进行HPLC 检测时，需要使用高纯度的甲醇或乙醇，以及高质量的免疫亲和柱和色谱柱，以确保检测结果的准确性和可靠性。同时HPLC 虽然成本低、灵敏度高且应用范围广,但需要实验人员进行复杂的样品前处理,而且分析方法耗费时间,仅适用于实验室,不适用于大量样品现场分析[11]。

5.2 液相色谱串联质谱法[12]

液质联用技术（LC-MS）是液相色谱与质谱串联，将样品中的黄曲霉毒素提取和初步净化后，再通过免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离后，串联质谱检测，同位素内标法定量。液相色谱串联质谱法检测黄曲霉毒素的方法主要包括以下几个步骤：

样品制备：将需要检测的样品进行加工，并通过适当的方法，如超声处理、萃取等，将其中的黄曲霉毒素提取出来，制成待检测的样品。

色谱分离：将样品注入到液相色谱仪中，通过柱子进行分离，将待检测的黄曲霉毒素与其它物质分离开来。

质谱检测：将分离后的物质送入串联质谱仪中进行检测。在串联质谱仪中，首先对待检测的物质进行电离，然后通过断裂、分离等过程对产生的离子进行分析和判定。

数据分析：得到质谱数据后，通过数据分析软件对信号进行拟合和计算，可以得到黄曲霉毒素的相对分子质量和含量，从而判断样品中是否存在黄曲霉毒素，并确定其含量。

液相色谱串联质谱法检测黄曲霉毒素的方法具有检测速度快、准确性高等优点，是目前广泛应用的一种检测方法。但需要注意的是，样品的制备、取样、仪器操作等都需要高度仔细，以确保数据的可靠性。LC-MS 法无需对样品进行衍生处理，具有分离能力强、灵敏度高、特异性好的特点，能较好满足食品中AFT 检测的要求，但要求测试人员必需掌握一定的专业知识，否则难以操作；高昂的仪器成本和复杂的分析测试决定了检测通常只能在实验室中进行，不能满足现场检测的要求等制约了其进一步推广。因此，开发易操作、低成本、可用于现场检测真菌毒素的LC-MS 技术已成为未来研究的热点[13]。

5.3 酶联免疫吸附测定法[14]

酶联免疫吸附筛查法是以抗原与抗体的特异性反应、酶与底物的特异性反应为基础，借助酶促反应的放大作用，提高反应的灵敏度来检测某一特定物质，具有特异性强、灵敏度高等特点[15]。该方法利用特异性抗体与黄曲霉毒素结合，然后通过酶标记反应来检测样品中的黄曲霉毒素。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种常用的黄曲霉毒素检测方法，其具体步骤如下：

样品制备：将待测样品（如食品、饲料等）加入适当的提取液中，进行样品制备，得到黄曲霉毒素样品提取液。

酶标板涂覆：将黄曲霉毒素抗原涂覆在酶标板中，使其产生酶联免疫反应。

样品加入：将样品提取液加入酶标板中，使黄曲霉毒素与抗体结合。

洗涤：用缓冲液洗涤酶标板，去除非特异性结合物质。

加入检测抗体：加入与黄曲霉毒素结合的检测抗体，使其与已结合的黄曲霉毒素形成复合物。

加入酶标记抗体：加入与检测抗体结合的酶标记抗体，使其与已形成复合物结合。

加入底物：加入底物，使酶标记抗体与底物发生反应，产生颜色。

读取结果：用酶标仪读取吸光度值，根据标准曲线计算出样品中黄曲霉毒素的含量。

ELISA 方法可以快速、准确地检测黄曲霉毒素，但样品制备、抗体选择和操作技术等因素可能会影响检测结果的准确性。因此，在进行检测时应严格按照操作规程进行，确保检测结果可靠。

5.4 胶体金快速定量法

该方法利用试样提取液中黄曲霉毒素B1与检测条中胶体金微粒发生成色反应，颜色深浅与试样中黄曲霉毒素含量相关。用读数仪测定检测条上检测线和质控线颜色深浅，根据颜色深浅和度数仪内置曲线自动计算出试样中黄曲霉毒素B1含量[16]。胶体金快速定量法检测黄曲霉毒素的具体方法如下：

样品制备：将待检测样品取出，如谷物、食品等，将其研磨成细粉末，取约10 g 样品加入提取液中，震荡后，静置过滤。取混合液离心后取上清液加入稀释缓冲液，充分混匀后待测。

样品测定：将胶体金检测条取出，放置至室温，打开孵育器预热后，将检测条放入孵育器中，打开加样孔。移取待测溶液到加样孔中，关闭加样孔和孵育器。孵育后，取出检测条。观察检测条质控线和检测线显色情况，确保检测有效。

需要注意的是，胶体金快速定量法检测黄曲霉毒素的具体方法可能因不同品牌的检测卡而有所不同，具体操作步骤以使用说明为准。

5.5 光学显微镜法

该方法通过观察样品中的黄曲霉菌丝或孢子来判断样品中是否存在黄曲霉毒素。

样品制备：将待测样品加入生理盐水或PBS 缓冲液中，使其达到所需浓度。

制备准备：准备好显微镜、载玻片、盖玻片、吸管、移液器等实验工具。

处理样品：将样品加入载玻片上，用吸管将其均匀涂布在玻片上。

固定样品：将盖玻片轻轻压在载玻片上，使样品均匀分布在载玻片上。

焦距调整：将载玻片放入显微镜中，调整焦距，使样品清晰可见。

观察样品：通过显微镜观察样品，查看是否有黄曲霉毒素的存在。黄曲霉毒素通常呈现为黄色或绿色的荧光。

记录结果：记录检测结果，并根据样品浓度和检测方法进行分析和判断。

需要注意的是，光学显微镜法只能检测样品中是否存在黄曲霉毒素，不能确定其具体浓度。因此，建议将其与其它检测方法结合使用，以获得更准确的结果。

6 结语

黄曲霉毒素具有强毒性和高致癌性，在保存不当的粮食作物中易普遍存在，对人体健康存在很大威胁，因此应提高对黄曲霉毒素的重视认识，丰富黄曲霉毒素的防治手段，同时提高粮食作物的存储条件，增强黄曲霉毒素的检测方法的研究，高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、酶联免疫吸附测定法、胶体金快速定量法和光学显微镜法的应用场景和检测适用条件各有不用，通过研究选用合适的检测方法，更加全面、多角度维护粮食安全。