lncRNA Meg3在全反式维甲酸和转化生长因子β3影响小鼠腭突间充质细胞增殖过程中的作用

刘小转,张军喜,余增丽,王国旭,何志东,宋帅星,李 雪

1)河南省人民医院临床医学研究中心 郑州 450003 2)国家卫生健康委员会出生缺陷预防重点实验室;河南省人口缺陷干预技术研究重点实验室 郑州 450002 3)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州450001

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)Meg3是一个长度约为1 600个核苷酸的非编码RNA[1]。lncRNA Meg3分别定位于小鼠远端12号染色体和人类14号染色体[2]。Meg3参与细胞分化、增殖、迁移、上皮-间充质转化等多种生物学过程,也参与多种信号途径,尤其是转化生长因子 (transforming growth factor β,TGF-β)/Smad和维甲酸信号通路[3]。Meg3可直接激活TGF-β,参与调节TGF-β诱导的细胞增殖和分化[4-6]。TGF-β通过调控Smad信号通路参与多种细胞上皮-间充质转化过程[7-9],在腭发育和融合过程中至关重要。过量和缺乏维生素A均将导致小鼠和人类的腭裂,研究[10]中多用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)代替维生素A。研究[11]报道称atRA可显著抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖。而Meg3可能抑制atRA诱发腭裂胎鼠腭突间充质细胞增殖[12]。为了进一步明确Meg3在atRA和TGF-β3在胚胎发育过程中对胎鼠腭突间充质细胞增殖的作用,我们利用体外培养的胎鼠腭间充质细胞,通过siRNA沉默Meg3的表达,检测Meg3基因沉默前后atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂SPF级成年健康C57BL/6N近交系小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物合格证号:SCXK(京)2019-0006。胎牛血清(澳洲AusGeneX公司),中性蛋白酶(罗氏诊断公司),DMEM/F12培养基(美国HyClone公司),atRA、TGF-β3(美国Sigma公司),DMSO(郑州百之奇生物科技有限公司),Meg3 siRNA和阴性对照(NC)siRNA(上海吉玛生物有限公司),荧光原位杂交试剂盒(中国锐博公司),Power Up SYBR Green 试剂盒(中国诺唯赞公司),Trizol(美国Thermo公司),ECL显影液(上海雅酶生物科技有限公司)。

1.2 胎鼠腭突间充质细胞的分离及培养[10]取妊娠13 d胎鼠,在超净台中用眼科器械小心取下双侧腭板,并用PBS清洗2次,加入含有中性蛋白酶的试管中,放入37 ℃培养箱中消化数分钟,加入含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化。均匀接种在10 cm培养皿中,放入CO2培养箱中培养,当细胞融合度达到70%～80%时进行细胞传代。收集第2代对数生长期的胎鼠腭突间充质细胞,用于下述实验。

1.3 胎鼠腭突间充质细胞增殖检测将细胞密度调整为4×104个/mL,每孔100 μL接种于3个96孔板内。待细胞贴壁后,分别加入5 μmol/L atRA、10 μg/L TGF-β3,每组6个复孔,并设置1个对照孔。分别培养24、48、72 h后,每孔加入100 μL CCK-8溶液,继续培养4 h后,用多功能酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值,计算处理组吸光度/对照孔吸光度,实验重复3次。筛选atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞作用的最佳时间。

将细胞密度调整为4×104个/mL,接种于12孔板内。待细胞经过atRA、TGF-β3处理48 h后,弃掉培养基,用PBS洗涤3次。设未处理细胞为对照组。然后加入EdU(30 mmol/L)孵育2 h,山羊标记抗鼠IgG荧光二抗孵育1 h,并用DAPI染色后,使用荧光显微镜观察并拍照。每组5张片子,每张片子选取5个视野统计细胞总数和EdU阳性细胞数,计算EdU阳性率,评估细胞的增殖能力。

1.4 Meg3在胎鼠腭突间充质细胞中表达的检测收集经过atRA、TGF-β3处理48 h后第3代腭突间充质细胞。用Trizol裂解液裂解细胞提取RNA,反转录获得cDNA后,将其进行稀释,按照Power Up SYBR Green试剂盒说明书配制反应体系,并采用实时定量荧光PCR扩增仪ABI 7500进行扩增,引物序列见表1,以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次。

表1 引物序列

1.5 Meg3在胎鼠腭突间充质细胞内的定位表达将第3代腭突间充质细胞按照4×104个/mL的密度接种于12孔板中,按照1.3处理48 h后,使用40 g/L的多聚甲醛固定10 min,并用PBS冲洗数次,加入200 μL预杂交液孵育30 min,再用Meg3和18S探针37 ℃过夜孵育。然后分别用洗涤液Ⅰ～Ⅲ洗涤3次,并用DAPI进行染色。以18S作为阳性对照,观察荧光强度,用于评估Meg3在对照组与atRA组的表达及定位。

1.6 细胞转染实验收集第2代对数生长期的细胞,以1.5×104个/孔接种于6孔板。将NC siRNA(正义链5’-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3’,反义链5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)和Meg3 siRNA(正义链5’-CCUUCCUCACCUCCA AUUUTT-3’,反义链5’-AAAUUGGAGGUGAG GAAGGTT-3’)溶解于转染试剂中,以10 mmoL/孔的浓度加入到6孔板。转染8 h后,吸出孔内液体。将第3代细胞进行分组:对照组、NC siRNA组、Meg3 siRNA组、Meg3 siRNA+atRA组、Meg3 siRNA+ TGF-β3组。根据分组分别加入新的完全培养基、5 μmol/L atRA,10 μg/L TGF-β3。于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养48 h。然后采用CCK-8法和EdU法检测细胞增殖情况,方法同1.3。实验重复3次。

1.7 统计学处理采用SPSS 25.0进行数据分析。各组吸光度、EdU阳性率、Meg3相对表达量的比较均采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 atRA和TGF-β3处理时间的选择结果见表2。atRA在48、72 h时对胎鼠腭突间充质细胞的生长有抑制作用,而TGF-β3在24、48、72 h 3个时间点均有促进生长的作用。因此,后续实验atRA和TGF-β3处理时间选择为48 h。

表2 3组胎鼠腭突间充质细胞吸光度的比较(n=3)

2.2 atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响结果见图1、表3。与对照组相比,atRA可抑制腭突间充质细胞的增殖,TGF-β3可促进腭突间充质细胞的增殖。

图1 3组胎鼠腭突间充质细胞增殖情况(×20)

表3 3组胎鼠腭突间充质细胞EdU阳性率的比较

2.3 atRA和TGF-β3对腭突间充质细胞Meg3表达的影响结果见图2、表4。Meg3主要表达于胎鼠腭突间充质细胞核,少量表达于细胞质。atRA可促进腭突间充质细胞中Meg3的表达,TGF-β3可抑制Meg3的表达。

图2 3组胎鼠腭突间充质细胞中Meg3荧光原位杂交染色结果(×20)

表4 3组胎鼠腭突间充质细胞Meg3相对表达量的比较

2.4 Meg3基因沉默后atRA和TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响结果见图3,表5、6。与对照组相比,Meg3 siRNA组、Meg3 siRNA+atRA组和Meg3 siRNA+TGF-β3组胎鼠腭突间充质细胞增殖能力均增强。

图3 5组胎鼠腭突间充质细胞增殖情况(×20)

表5 5组胎鼠腭突间充质细胞吸光度的比较

表6 5组胎鼠腭突间充质细胞EdU阳性率的比较

3 讨论

在腭突发育过程中,细胞增殖和上皮-间充质转化作为基本的生理过程,任何胚胎腭间充质细胞增殖和转化的异常都可能导致腭裂的形成[13]。在胚胎发育过程中,atRA可以通过抑制间充质细胞增殖导致腭裂[14]。有文献[15]报道,与野生型TGF-β3(+/+)小鼠相比,TGF-β3(-/-)小鼠腭突间充质细胞增殖能力显著降低。这表明TGF-β3在胎鼠腭突间充质细胞增殖过程中具有极其重要的作用。本研究中为了确定atRA、TGF-β3有效作用时间,采用CCK-8实验检测atRA、TGF-β3在不同干预时间条件下对腭突间充质细胞增殖的影响,结果显示从48 h起atRA对胎鼠腭突间充质细胞的增殖产生抑制作用,TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞的增殖起促进作用。因此,我们在后续研究中选择48 h作为处理时间。

本研究通过EdU实验发现,atRA可显著抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖,而TGF-β3可促进胎鼠腭突间充质细胞的增殖,与以往研究[9]结果一致。因此,我们推测TGF-β3参与胎鼠腭突间充质细胞增殖的调节。

lncRNA Meg3参与多种细胞增殖、迁移、上皮-间充质转化等过程,同时也参与众多信号通路的激活与抑制,尤其是TGF-β信号通路[16]。有研究[17]称Meg3可与Smad2等基因形成空间三维结构,影响下游信号通路的激活。本研究结果显示,在腭突间充质细胞中,atRA可明显促进Meg3的表达,而TGF-β3抑制Meg3的表达,由此提示Meg3可能在atRA、TGF-β3作用于胎鼠腭突充质细胞的过程中具有不可替代的作用。为进一步明确Meg3在atRA、TGF-β3作用于腭突间充质细胞增殖过程中的作用,本研究利用Meg3 siRNA转染胎鼠腭突间充质细胞,沉默Meg3基因的表达,然后,采用CCK-8、EdU实验检测Meg3 siRNA转染前后atRA和TGF-β3对腭突间充质细胞增殖的影响。结果显示:Meg3基因沉默前,atRA可抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖,TGF-β3可明显促进胎鼠腭突间充质细胞的增殖;Meg3基因沉默后,与对照组相比,Meg3 siRNA组胎鼠腭突间充质细胞增殖能力均显著增高,由此可见,Meg3基因在胎鼠腭突间充质细胞增殖过程中具有重要的作用。Meg3基因沉默后,atRA对腭突间充质细胞增殖的抑制作用减弱,而TGF-β3对胎鼠腭突间充质细胞增殖的促进作用仍然显著。另外,结合atRA对腭突间充质细胞中Meg3表达的促进作用,TGF-β3对Meg3表达的抑制作用,可以推断:Meg3基因是调控胎鼠腭突间充质细胞增殖的重要基因;atRA可能通过促进Meg3基因的表达,从而抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖,而TGF-β3对腭突间充质细胞的增殖促进作用可能与Meg3基因无直接关联,详细的机制还需要进一步的研究。