昆明地区HBsAg与抗-HBs双阳性慢性HBV感染患者流行病学调查及PreS/S基因突变特征*

白丽萍 张颖慧 杨雪艳 白丽仙 马志坚

(1.云南大学附属医院消化内科,云南 昆明 650021;2.玉溪市人民医院儿科,云南 玉溪 653199;3.昆明市第一人民医院急诊科,云南 昆明 650031)

乙型病毒性肝炎(以下简称乙型肝炎)是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染常见的慢性病毒感染疾病[1],临床上通常采用血清学标志物对乙型肝炎进行筛查,其中乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)具有较强的免疫性原,可诱导机体产生抗-HBs,从而与外周血中循环HBsAg和HBV颗粒进行特异性中和反应,二者无法共存[2-3]。然而,临床研究证实[4],HBV感染者可能存在HBsAg/抗-HBs双阳性的异常情况,且机制尚不明确。有研究发现HBsAg与抗-HBs双阳性可能会促进肝纤维化、肝细胞癌的发生和发展[5]。目前的研究[6-7]认为,HBsAg/抗-HBs均为阳性与HBsAg的核苷酸序列发生变异有关,尤其是MHR、a决定簇突变,但由于患者感染HBV的基因型存在差异,导致国内外研究结果对于HBsAg/抗-HBs双阳患者HBsAg中氨基酸发生突变最常见位点存在差异。因此,本研究旨对HBsAg/抗-HBs双阳性慢性HBV感染患者进行流行病学调查,并进一步分析患者PreS的基因突变特征,以期为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年5月—2022年4月于云南大学附属医院门诊定量检测乙肝两对半的438例慢性HBV感染患者为观察对象,将202例HBsAg/抗-HBs同时阳性者作为观察组,将236例HBsAg(+)/抗-HBs(-)的慢性HBV感染者作为对照组。纳入标准:①HBV DNA >103IU/mL,HBsAg阳性。②临床病理资料齐全。排除标准:①合并其他病毒性肝炎。②合并免疫功能障碍。

1.2 主要仪器与试剂 ADV2400全自动生化分析仪(Simens,德国),荧光定量PCR仪(Roche,瑞士),ABI7300荧光定量PCR检测仪(ABI,美国)。HBV核酸定量测定试剂盒(上海通派生物科技有限公司),病毒DNA/RNA提取试剂盒(ThermoFisher, 美国),ALT检测试剂盒(Simens,德国),Premix Taq、PMD 19-T Vector Cloning Kit、E.coli JM109 Competent Cells及PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa,日本)。

1.3 检测HBsAg与抗-HBs 采用化学发光仪进行HBsAg与抗-HBs检测,检测过程严格按照试剂盒操作规程。判定标准:HBsAg>0.05 IU/mL为阳性;抗-HBs>10 mIU/mL为阳性。

1.4 血清HBV DNA提取及检测 采集血清样本,提取HBV DNA,使用ABI7300荧光定量PCR检测仪进行定量检测,检测范围为5×102～5×109IU/mL。

1.5 HBV DNA 的PreS/S 区PCR扩增与序列检测 使用Expand High Fidelity PCR system进行巢式PCR扩增,第一轮以HBV DNA为模板,第二轮以第一轮PCR产物为模板。PCR引物由上海生工合成,第一轮扩增引物:HBV Del-F-out:5′-GCCTCATTTTGYGGGTCACCATATTC-3′;HBV Del-F-in:5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3′; HBV-975:5′-AATTCGTTGACANACTTTCCAATCAAT。第一轮PCR反应体系为:ExTaq 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、并无菌去离子水补足至总体积25 μL。PCR反应条件为:95 ℃变性10 s,55 ℃退火15s,72 ℃延伸90s,共39个循环,最后72 ℃修复延伸5 min。第二轮PCR反应体系为:ExTaq 25 μL、上下游引物各1 μL、并无菌去离子水补足至总体积50 μL。PCR反应条件为:95 ℃变性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸90 s,共39个循环,最后72 ℃修复延伸5min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物目的条带,并送至上海生工进行测序,测序结果用CExpress、BioEdit等软件进行拼接,并于NCBI的GenBank中HBV野生株对比,确定基因型。

2 结果

2.1 两组患者年龄频数分布 统计两组不同年龄段患者人数结果显示,观察组HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群更多见,而对照组HBV感染者在20～49岁HBsAg阳性人群更多见,见图1。

图1 两组患者年龄频数分布折线图

2.2 两组患者临床特征比较 与对照组比较,观察组患者年龄更大、HBsAg<250 IU/mL比例和HBV基因C型比例更高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组患者临床特征比较

2.3 两组不同基因型患者临床资料比较 成功扩增PreS/S并测序成功的观察组样本共132例,其中B型基因81例,C型基因51例;对照组样本中B型基因110例,C型基因65例。对比两组患者临床资料,结果显示,与观察组比较,对照组HBV DNA更高,差异具有统计学意义(P<0.05),其他临床资料两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 不同基因型患者临床资料比较

2.4 两组HBsAg氨基酸突变率比较 对比两组患者氨基酸突变率发现,B型基因患者中,与对照组比较,观察组N末端区域突变率更高,差异具有统计学意义(P<0.05),两组患者C末端区域、MHR、a决定簇突变率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。C型基因患者中,与对照组比较,观察组MHR、a决定簇及N末端区域突变率更高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 不同基因型患者HBsAg氨基酸突变率比较[n(×10-2)]

2.5 两组PreS基因缺失突变特征 PreS基因缺失突变位点及缺失大小,见表4。132份观察组样本中,PreS基因缺失突变发生率为25.00%(33/132),其中81例B型基因患者PreS基因缺失突变14例(17.28%),51例C型基因患者中PreS基因缺失突变19例(37.25%),而在对照组中未发现PreS基因缺失突变与对照组比较,观察组PreS基因缺失突变率更高(0/110vs33/81),差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 PreS基因缺失突变位点及缺失大小

3 讨论

HBV感染患者血清HBsAg/抗-HBs双阳性在临床HBV血清学标志物检测中不多见,目前机制尚不明确,多认为与基因突变、免疫逃逸及不同血清亚型共感染有关[8]。有研究[9]证实,HBsAg/抗-HBs双阳性与肝纤维化、母婴阻断失败的发生密切相关,可能是诱发肝癌的独立危险因素。因此,对慢性HBV感染患者的临床特征进行分析,并探究其流行病学模式对于肝病防治具有重要意义。

本研究结果显示,HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群多见,分析可能的原因为低龄儿童机体免疫功能尚未完善,随着年龄的增长,免疫系统逐渐发育成熟,抗HBs阳性率逐渐降低[10];对于老年人群,其易感染不同基因型HBV,且其免疫功能较年轻人群显著降低,HBV S蛋白突变增加,抗HBs阳性率逐渐增加[11]。而HBsAg(+)/抗-HBs(-)患者在30～39岁HBsAg阳性人群更多见,分析可能的原因为上世纪90年代开始我国开始推广新生儿HBV疫苗接种,极大的降低了新生儿的感染率,而20～49岁人群的获益情况不佳,感染率明显增加,随着机体功能的变化,HBV感染者进展为肝癌、肝硬化等导致其死亡,降低了抗HBs阳性率[12]。进一步分析两组患者的临床特征发现,观察组患者年龄较对照组显著增加,HBsAg>250IU/mL患者则较对照组显著降低,与傅晓春等[13]的研究结果一致。两组患者的临床诊断结果显示,观察组乙肝携带者比例较对照组显著增加,结合既往研究结果[14-15],我们推测抗-HBs对HBsAg具有部分中和作用,对HBsAg/抗-HBs双阳性患者具有一定的保护效应。此外,C型HBV感染者比例较对照组显著增加,而有研究结果显示,在我国南方城市C型HBV感染比例显著高于B型人群[16],推测可能与基因突变位点相关。

目前的研究[17]认为,血清中HBsAg/抗-HBs双阳性与HBsAg突变,尤其是MHR和a决定簇有关,HBsAg突变可引起抗原性改变,抑制HBsAg与HBs的结合,导致血清HBsAg/抗-HBs双阳性。本研究中HBsAg/抗-HBs双阳性患者HBV PreS/S区核苷酸替换突变率高于单阳患者,与B型基因比较,C型基因HBsAg突变率更高,且在B型基因患者中,单阳患者N末端区域突变显著低于双阳患者,而在C型基因患者中,双阳患者MHR、a决定簇及N末端区域氨基酸突变率均显著高于单阳患者。a决定簇是S蛋白免疫优势区,位于aa124～147[18],本研究C型基因患者突变位点位于a决定簇aa126位点,与国外研究存在差异,推测可能与观察对象HBV基因型存在差异有关。研究[19]表明,C型基因在病毒复制水平上明显高于B型基因,且更容易引起肝炎、肝硬化等。但HBsAg/抗-HBs双阳患者比例较低,相关的免疫突变关系仍需进行深入研究。HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染患者中存在PreS基因缺失突变,PreS编码的蛋白是病毒结合及免疫反应的重要靶点,其突变缺失可能导致肝损害加重[20]。本研究中双阳HBV感染患者PreS基因缺失突变发生率为25.00%,且在B型和C型基因患者中存在显著差异,而在单阳患者中未发现PreS基因缺失突变。但本研究纳入的样本量较少且数据来自单一中心,增加了选择偏倚的风险,尚需增加样本数量及来源深入研究以得出更为可靠的结论。

4 结论

HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群多见,提示HBsAg/抗-HBs双阳性可能与HBsAg突变及PreS基因突变有关。