MenSCs对PCOS大鼠卵巢损伤修复、生殖系统及HSP90表达的影响*

常庆玲 蔡文涛 陈丽华

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院生殖科,河南 洛阳 471000;2.慈铭博鳌国际医院生殖中心,海南 琼海 571442;3.河北北方学院附属第一医院生殖科,河北 张家口 075000)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的内分泌紊乱疾病,其发病率高达5%～10%,是女性无排卵不孕的的最常见原因[1]。PCOS通常在青少年时期开始出现,其临床表现具有显著的差异性,常见的临床表现为月经异常、不孕、多毛、痤疮等。此外,PCOS还常伴有高血压、心血管疾病、子宫内膜癌等多种并发症。相关调查显示[2],育龄期女性PCOS发病率接近15%,在无排卵性不孕患者中该病的发病率在90%以上,是目前致使女性不孕的主要原因。PCOS引起的无排卵性不孕是妇科的研究难点,也是我国生育保健的难题。研究发现[3],抑制干细胞后改善局部微环境及病理状态,能提升机体相关器官的功能,且对受试者无不良影响。目前,关于间充质干细胞应用于妇科内分泌疾病治疗的研究逐渐增加。研究发现[4],将骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived MSCs,BM-MSCs)移植到卵巢早衰大鼠体内,发现可缓解顺铂引发的颗粒细胞凋亡;另外,研究将经血间充质干细胞(Menstrual blood mesenchymal stem cells,MenSCs)移植到Asherman综合征大鼠体内,发现在移植后可增强血管生成因子和抗炎性因子的分泌,提高Asherman综合征大鼠的妊娠率以及产仔率[5]。MenSCs是从育龄女性的经血中提取出的,易于收集,来源丰富,其免疫原性与炎性反应较低,显著优于其他类干细胞,同时还具有较高的组织容受性,增殖及自我更新能力较好,还可分化为骨细胞、软骨细胞、神经元细胞等[6]。另有研究发现[7],MenSCs在特定条件下还可分化为卵巢颗粒样细胞并具有该细胞的相关功能,具有修复损伤卵巢组织并促进再生的作用。另外,热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)也参与PCOS的产生与发展,并在其中发挥着重要的作用。HSP90隶属于HSP家族,具有分子伴侣等多种功能,参与免疫调控、抗细胞凋亡等过程。研究显示[8],PCOS是由于机体处于长期应激或卵巢内卵母细胞/颗粒细胞不正常凋亡所致,而这两种状态均有HSP的参与。目前有关运用MenSCs治疗PCOS的相关文献较少,具体的治疗机制尚未完全掌握。因此,本文通过构建PCOS动物模型,研究MenSCs移植对PCOS大鼠HSP90表达、卵巢损伤修复及生殖系统的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康SPF级SD雌性大鼠40只,体质量200～300 g,由长沙市海天勤公司提供[生产许可证号:SCXK(湘)-2019-0014]。大鼠于中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院动物实验室进行饲养,实验室保持整洁、通风,维持昼夜规律,室温在20～22 ℃,相对湿度在55%左右,每个鼠笼中饲养5只大鼠,鼠笼中保持充足的饮用水及营养饲料,适应性饲养1周后进行实验。本实验已通过我院动物伦理委员会批准(批号:19081123)。

1.2 主要实验试剂及仪器 FSH、LH、LH试剂盒(上海研生实业公司),PPARG1、NCOR1、HDAC3引物序列(上海齐源生物公司),来曲唑(上海沪峥生物科技有限公司,货号:Hhzy-2885),羟甲基纤维素钠(武汉荣灿生物科技有限公司,货号:9085-26-1),PCR仪(北京福意电器公司,型号:431L),HSP90一抗(中国,碧云天生物公司),辣根过氧化物酶二抗(北京博尔西科技公司)。

1.3 细胞来源及培养 MenSCs细胞株由杭州易文赛生物技术有限公司提供。将MenSCs细胞放入含有10%胎牛学清的DMEM培养基中常规培养,待细胞融合至70%～80%时传代,取第3代细胞进行实验。显微镜下观察MenSCs呈梭状,成旋涡状排列,贴壁生长,具有典型的MSCs的细胞特征(图1)。运用流式细胞仪检测了其表面分子标志物,显示在该细胞中存在CD29、CD73、CD90、CD105的表达,不表达CD34、CD45、CD117和HLA-DR,符合国际细胞治疗学会建议的关于间充质干细胞的标准。

图1 MenSCs细胞形态

1.4 模型建立及分组 40只大鼠按照随机数字方法分为健康组、模型组、治疗组及对照组,每组10只。除健康组外,剩余30只大鼠均建立PCOS模型[9]:给予1 mg·kg-1·d-1来曲唑(溶于0.5%羟甲基纤维素钠1 mL)灌胃,高脂饲料喂养,直至出现多囊卵巢样改变以及高表达的睾酮(testosterone,T)提示建模成功。10只PCOS模型大鼠为模型组;10只PCOS模型大鼠于大鼠尾部静脉注射200 μL(5×107个/mL)MenSCs悬液[10],共饲养2周为治疗组;10只PCOS模型大鼠予二甲双胍20 mg·kg-1·d-1灌胃,共饲养2周为对照组。

1.5 检测指标

1.5.1 ELISA检测性激素水平 取4组大鼠外周血2 mL,离心5 min,1 250 r/min,后取血清。ELISA试剂盒检测促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinising hormone,LH)、睾酮(T),实验严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2 阴道涂片观察动情周期 每日上午8:00时用棉签将大鼠阴道口处赃物擦净,运用无菌柔软的习惯吸取0.5 mL的生理盐水放于阴道口0.5 cm处进行吹打,并冲洗,吸出冲洗液,离心1 min,3000 r/min,吸取50 μL液体放入载玻片上,涂匀后晾干。4%PFA滴至涂片上固定标本 30 min。 PBS 浸泡,摇床振动,清洗后涂在载玻片上,吉姆萨染色,冲洗后光镜下观察,根据细胞种类、形态判断动情周期。动情前期:有大量核上皮细胞,圆形深染;动情期:大量角化细胞,无核片状;动情后期:可见上皮细胞,角化细胞,白细胞,各占三分之一;动情间期:有大量白细胞。见图2。

图2 健康大鼠与模型大鼠阴道涂片

1.5.3 RT-PCR检测生殖功能相关指标PPARG1、NCOR1、HDAC3 mRNA表达水平 取4组大鼠卵巢组织,剪碎、研磨、离心后,Trizol提取总RNA后逆转录合成cDNA。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,36个循环;72 ℃ 10 min。以U6为内参,用2-ΔΔCt计算相对表达量,引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.4 HE染色观察卵巢病理形态并计数 取4组大鼠戊巴比妥钠麻醉后处死,取卵巢组织,手术刀剪成小块,甲醛固定,冲洗1 h,脱水,浸蜡,包埋,切5 μm片,HE染色后中性树胶封固,光镜下观察卵巢组织病理学形态并计数卵泡数。

1.5.5 免疫印迹检测HSP90 取4组大鼠卵巢组织剪碎后研磨,裂解液裂解,冰浴中静置20 min后,离心取上清,BCA测定蛋白浓度,电泳仪电泳,后进行转膜,转膜终止后,PBS冲洗5 min,用丽春红染膜,观察转膜效果,然后用PBS将丽春红冲洗干净,用封闭液封闭1.5 h,按照一定比例稀释一抗,加入稀释的HSP90(1∶500)一抗,孵育过夜,PBS清洗,加入辣根过氧化物酶二抗(1∶2000),孵育1 h后清洗,ECL化学发光试剂盒曝光显影3 min,计算HSP90蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 MenSCs对4组大鼠动情周期的影响 健康组大鼠动情周期稳定;与健康组相比,模型组大鼠动情周期无规律,动情前期、动情间期时间延长,动情期时间缩短(P<0.05);与模型组相比,治疗组与对照组小鼠动情周期数、动情期时间增加,间期时间减少,周期相对规律(P<0.05);治疗组与对照组动情周期比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 MenSCs对4组大鼠动情周期的影响

2.2 MenSCs对4组大鼠性激素水平的影响 与健康组相比,模型组FSH降低、LH与T升高(P<0.05);与模型组相比,治疗组FSH升高、LH与T降低(P<0.05);治疗组与对照组FSH、LH、T水平比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 4组大鼠性激素水平比较

2.3 MenSCs对4组大鼠生殖功能相关指标mRNA表达的影响 与健康组相比,模型组PPARG1 mRNA降低,NCOR1 mRNA 、HDAC3 mRNA升高(P<0.05);与模型组相比,治疗组PPARG1 mRNA升高,NCOR1 mRNA 、HDAC3 mRNA降低(P<0.05);治疗组与对照组各指标mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 4组大鼠生殖功能相关指标mRNA表达比较

2.4 MenSCs对4组大鼠卵巢组织病理形态的影响 健康组大鼠卵巢组织结构正常;模型组大鼠卵巢结构紊乱,可见较多闭锁坏死卵泡、较多卵泡囊性扩张、 颗粒细胞疏松且层数减少、成熟卵泡内未见卵母细胞、放射冠消失,发育期卵泡与黄体数量明显减少;与模型组相比,治疗组与对照组大鼠卵巢组织有所改善,见图3。与健康组相比,模型组原始卵泡、生长卵泡数量减少,闭锁卵泡数量增加(P<0.05);与模型组相比,治疗组与对照组生长卵泡数量增加、闭锁卵泡数量减少(P<0.05);治疗组与对照组生长原始卵泡数量比较差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5 4组不同时期卵泡数比较个)

图3 MenSCs对4组大鼠卵巢组织病理形态的影响

2.5 4组大鼠卵巢组织HSP90蛋白表达的影响 健康组、模型组、治疗组及对照组的HSP90蛋白表达水平分别为(1.52±0.25)、(0.26±0.03)、(0.85±0.11)及(0.87±0.10)。与健康组相比,模型组HSP90蛋白表达降低(t=20.450,P<0.001);与模型组相比,治疗组HSP90蛋白表达升高(t=25.330,P<0.001);治疗组与对照组HSP90蛋白表达水平比较差异无统计学意义(t=0.595,P=0.559),见图4。

图4 MenSCs对4组大鼠卵巢组织HSP90蛋白表达的影响

3 讨论

应激状态通过激活HSP90影响性激素平衡,使得卵泡发育失常,导致多囊卵巢发生[11]。HSP90主要定位于卵巢的颗粒细胞中,在闭锁的卵泡中显著减少[12-13]。LH通过刺激卵泡膜增加雄激素含量,阻滞卵泡成熟,未成熟的卵泡会分泌雌二醇并转化为雌酮,此时机体雌酮为异常高表达,促进LH分泌,形成恶性循环,使FSH水平降低,从而发展为多囊卵巢的症状[14]。本研究结果显示,PCOS大鼠无明显动情周期,且促黄体酮生成素、睾酮水平增加,呈现多囊卵巢样病变,同时HSP90水平下降,与吴庚香等[15]报道一致。MenSCs细胞具有较低的免疫原性,可以逃避宿主免疫系统的清除而不引起免疫应答,是MenSCs细胞成为临床细胞治疗强有力的候选者的原因之一[16]。与其他多种干细胞相比,MenSCs细胞具有增殖快等特点,异体移植成功率高,当MenSCs细胞移植于机体内后,通过“归巢”方式修复损伤卵巢[17-19]。有研究[20]显示,MenSCs可能只在PCOS特殊病理条件下起作用,通过这种环境里的某种机制增加了PCOS大鼠芳香化酶的产生,进而促使卵巢颗粒细胞内雄激素向雌激素的转化量增加。目前已有研究证实[9]二甲双胍对PCOS的治疗效果显著,因此本研究运用二甲双胍作为对照组,证实移植MenSCs后对PCOS的治疗效果。在本研究中,与模型组相比,移植MenSCs细胞后治疗组FSH、LH、T水平有所改善、多囊状扩张的卵泡减少,这提示干细胞移植对PCOS大鼠有明显的治疗效果,这与刘荣华[10]研究一致。治疗组与对照组FSH、LH、T水平比较无差异,说明移植MenSCs与运用二甲双胍干预PCOS的治疗结果相接近。

为研究MenSCs细胞对HSP90的作用,本研究认为MenSCs细胞通过升高HSP90表达,改善性激素水平,从而达到治疗PCOS大鼠的作用。PPARG1参与机体糖脂代谢、细胞生物学行为等过程,影响PCOS等多种疾病的产生[21]。PPARG1在维持卵巢功能正常运转上具有重要作用,参与颗粒细胞的增殖、分化以及卵巢组织的重塑等[22]。研究发现[23],PPARG激动剂可有效改善PCOS患者的高雄症及排卵障碍,提示PPARG1在PCOS患者体内低表达,对卵巢卵泡发育中具有重要作用。PPARG1是一种转录因子,其需要与多种调节因子相互作用,共同完成转录作用,NCOR1和HDAC3是其中两个最重要的共抑制子[24]。NCOR1通过接受核受体的招募发挥转录作用,可与HDAC3稳定结合后成为HDAC3的激活亚单位,参与机体生殖发育全过程[25]。本研究发现,模型组大鼠体内PPARG1降低,NCOR1、HDAC3升高,在经过MenSCs治疗后PPARG1升高,NCOR1、HDAC3降低,且与对照组较为接近。陈夏凉[26]研究显示,在PCOS大鼠体内通过改善性激素水平,可促进PPARG1升高及NCOR1、HDAC3降低,从而达到对PCOS大鼠的治疗作用。本文研究与上述研究结果相似。

4 结论

移植MenSCs细胞后可改善PCOS大鼠的生殖功能及卵巢功能,可能通过上调HSP90表达影响性激素水平从而改善卵巢损伤。