芬戈莫德对抑郁大鼠行为学及单胺类神经递质的影响

张玲 张磊 王建楠 刘思芸 隋汝波

(锦州医科大学 1附属第一医院神经内科,辽宁 锦州 121000;2护理学院;3研究生院)

抑郁症在世界范围内的患病率为4%左右,在我国,这一比例高达5%～6%,受各种内外因素的影响,近年来该病的发病率不断上升〔1〕。目前抗抑郁药主要为5-羟色胺再摄取抑制剂及三环类药物,仅仅为补充单胺类神经递质的减少,本质上为对症治疗,治标不治本,且疗效不一〔2,3〕,所以进一步寻找新的治疗途径至关重要。在抑郁症发生发展过程中,炎症因子发挥着重要作用,主要表现为炎症反应系统的激活〔4,5〕。研究显示〔6〕,环氧化酶-2抑制剂塞来昔布可用于抗抑郁,但由于该种药物的作用仅局限于炎症反应的单一靶点,因此抗抑郁效果十分有限。而主要作用于T淋巴细胞的1-磷酸鞘氨醇受体调节剂芬戈莫德(FTY720)可以抑制炎症反应中的上游因素〔7〕,因此在抑制炎症反应方面更加有效。FTY720主要发挥T淋巴细胞从次级淋巴器官迁出的抑制作用,可以降低促炎因子水平,此外还能否减少脑内炎症细胞浸润,改善由慢性温和不可预知应激所致的抑郁尚不明确〔8,9〕。本实验选用FTY720进行免疫干预,采用行为学、分子生物学、组织病理学等实验方法,探讨FTY720对大鼠抑郁行为的影响及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物:由锦州医科大学实验动物中心提供,50只SPF 级SD大鼠〔动物许可证号 SCXK(辽)2017-0006〕,雄性,平均体质量(200±15)g。

1.2实验前准备 ①适应性喂养。于锦州医科大学 SPF 动物实验室适应性喂养1 w。②所有大鼠开展敞箱实验和糖水消耗实验。③测量基线体质量。④选取体质量和行为学指标等基线值均衡可比大鼠为试验大鼠。总共50只。本试验开展前获得锦州医科大学伦理委员会批准。

1.3实验试剂及仪器 由美国Sigma公司提供FTY720,苏州礼来制药有限公司提供盐酸氟西汀胶囊,沈阳万类生物有限公司提供兔抗大鼠去甲肾上腺素(NE)抗体、兔抗大鼠白细胞介素(IL)-1β抗体、兔抗大鼠IL-6抗体、兔抗大鼠多巴胺(DA)、兔抗大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及5-羟色胺(HT)抗体。美国R&D公司提供酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。德国Leica公司提供RM2235型石蜡切片机,日本Olympus公司提供BX53型显微镜,美国Biotek公司提供ELX-800型酶标仪。

1.4动物分组及造模 实验大鼠按照随机数字表法分为慢性不可预见的温和性应激(CUMS)组,对照(Con)组,FTY720低、中、高剂量(FTY-L、FTY-M、FTY-H)组,每组10只。除Con组外,其余各组均建立抑郁模型〔10〕,给予大鼠禁食水、潮湿垫料、倾笼、行为限制、昼夜颠倒、4 ℃冰浴游泳、电击足底、夹尾等9种刺激方法,建模大鼠每天进行1种刺激,刺激方式在上述9中方法中随机选取1种,共刺激3 w。在进行上述刺激前1 d,各组均分别腹腔注射给药,其中Con组和CUMS组均给予等体积去离子水,FTY-L组、FTY-M组和FTY-H组分别给予0.5、1.0、2.0 mg/kg FTY720。

1.5体质量 共进行4次体质量测量,测量时间为刺激前1 d、刺激后第8、15及22天。

1.6糖水消耗 根据文献〔7〕方法,对造模大鼠给予蔗糖水(浓度为1%)75 ml,并同时给予75 ml蒸馏水,观察并记录大鼠行为,1 h后,将上述蔗糖水和蒸馏水取出,测量并记录大鼠消耗的水量,并由此推算大鼠糖和水的消耗比例。

1.7敞箱实验 参照标准试验方法〔11〕,所使用的敞箱为自制箱,箱壁为黑色,底部为白色,且无需加盖(箱子长和宽均为80 cm,高50 cm)。在箱子的底部用黑色笔划分25个等格,再将各大鼠置于所划分的中心方格内。在5 min时间内,观察并记录大鼠穿越格数和两后肢直立次数,上述记录值分别代表大鼠的水平和垂直运动得分。

1.8苏木素-伊红(HE)染色 实验动物造模完成后,各大鼠取血,迅速采用4%多聚甲醛于心脏进行灌注固定,并取大鼠大脑的海马组织,先后经过脱水、透明、浸蜡与包埋步骤制作海马组织蜡块,并常规切片,HE染色观察大鼠海马组织形态学改变。

1.9Western印迹 造模完毕且大鼠取血后,将大鼠断头取脑,于冰块上分离大鼠的海马组织,然后加入200 μl RIPA裂解液〔含1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕,于冰块上研磨成组织匀浆,4 ℃ 12 500 r/min离心15 min后取上清,依照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒说明书进行蛋白定量。蛋白定量完成后开展聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。加入一抗前,利用脱脂牛奶(浓度为5%)进行封闭。一抗成分为:兔抗大鼠DA(1∶300)、兔抗大鼠5-HT(1∶500)、兔抗大鼠NE(1∶500)。加入一抗后设定温度为4 ℃,摇床24 h,TBST缓冲液洗涤,按10 min/次的频率共洗涤3次,加入HRP标记的羊抗兔(1∶5 000)二抗,室温孵育2 h。按5 min/次的频率采用TBST缓冲液进行洗涤,共洗涤3次,电化学发光,灰度分析采用ImageJ软件。

1.10ELISA 抑郁造模完毕后经腹主动脉取血,12 500 r/min离心,离心后取上清,待测。严格按试剂盒说明书开展ELISA。A450 nm应用酶标仪进行检测,最后计算相应样本浓度,主要根据标准曲线开展。

1.11统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、q检验。

2 结 果

2.1实验动物一般状态 Con组进食水情况较好,鼠毛顺滑无脱落,较活跃。CUMS组进食减少,体质量增长缓慢,鼠毛毛躁且脱毛严重,活动量锐减。FTY-L、FTY-M、FTY-H组进食水略差,鼠毛基本无脱落,活动量尚可。

2.2体质量情况 Con组体质量变化与饲养时间有关,时间越长其体质量增加越多(P<0.05)。CUMS组体质量增长缓慢,仅刺激后第22天与刺激前比较差异有统计学意义(P<0.05)。CUMS组和FTY-L、FTY-M、FTY-H组体质量在刺激后第8、15、22天均显著低于Con组(P<0.05);FTY-L组体质量在刺激后第22天显著高于CUMS组(P<0.05);FTY-M、FTY-H组体质量在刺激后第15、22天显著高于CUMS组(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间体质量及水平运动、垂直运动得分、糖水消耗比例情况

2.3敞箱实验及糖水消耗实验 与Con组的水平运动、垂直运动得分及糖水消耗比例相比,CUMS组上述各指标显著更低(P<0.05);与CUMS组相比,FTY-M、FTY-H组水平运动、垂直运动得分及糖水消耗比例显著更高(P<0.05)。见表1。

2.4大鼠海马组织形态学改变 HE染色结果表明,Con组海马组织各区神经元形态完整而饱满,神经元排列致密且有序;CUMS组CA1区神经元表现萎缩,神经元排列紊乱且稀疏,核固缩等凋亡现象;FTY-M及FTY-H组神经元排列紧密有序,细胞形态饱满,核固缩等细胞凋亡现象显著减少,见图1。

图1 各组海马组织形态学(HE染色,×400)

2.5大鼠海马组织DA、5-HT及NE表达水平 与Con组相比,CUMS组海马组织中DA、5-HT及NE表达明显下降(P<0.05);与CUMS组相比,FTY-M及FTY-H组DA、5-HT及NE表达明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组海马组织DA、5-HT及NE表达及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

2.6大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α比较 与Con组比较,CUMS组血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量明显上升(P<0.05);与CUMS组比较,FTY-L、FTY-M、FTY-H组血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

3 讨 论

本实验结果表明,大鼠抑郁模型造模成功;给予FTY720后,尽管不能完全恢复到Con组水平,但抑郁大鼠的体质量增长率在一定程度上有所增加,且可显著提高大鼠行为学评分,即改善抑郁大鼠食欲减退、快感缺失、运动下降和探索行为下降等抑郁核心症状。综上,本实验结果证实应用FTY720可显著改善大鼠抑郁行为。

本研究进一步实验结果显示,抑郁大鼠的海马组织有严重的神经元损伤现象,且主要集中于CA1区,而FTY720则可以抑制这种现象的发生。其可能是因为,海马在学习及情感表达过程中发挥重要作用。此前相关研究表明,抑郁大鼠的海马神经元多半会出现再生障碍,且随着再生障碍程度的不断加深,海马神经元甚至会出现凋亡,此时便会发生抑郁〔12〕。据此推测,FTY720发挥改善大鼠抑郁行为正是通过改善抑郁大鼠海马组织神经元损伤而实现的。虽然目前缺乏相关研究,但有研究已证实FTY720对自闭症及阿尔茨海默病模型的海马组织神经元具有保护作用〔13,14〕。

DA、NE和5-HT均是抑郁症单胺类神经递质机制中重要组成部分,其中NE可参与机体多种生理功能的调节,如调节心血管活动、情绪、体温,此外,NE还参与机体的记忆与学习能力,并影响人体的睡眠与觉醒,还影响人体对痛觉与焦虑的感知等。当NE功能下降时,中枢神经系统中NE含量表达下降,则可引发抑郁症。5-HT是一种抑制性神经递质,其生理作用表现为副交感神经节前纤维被抑制,而交感神经节前纤维被兴奋。这种生物学作用,可以使其参与多项中枢神经运动,如情绪控制,还可以调节人体的睡眠,并影响机体的摄食行为,还影响人体的焦虑等负面情绪及性行为的发生等。而当机体处于应激状态时,5-HT的水平将随之发生变化,上述各种中枢神经运动也受到影响,由此便发生抑郁症等精神类疾病。多巴胺能中边缘奖赏系统的改变可能导致快感缺失〔15〕。所以DA、5-HT及NE的表达水平亦是反映抑郁现象的特异性指标。而5-HT再摄取抑制剂等抗抑郁药物通过提高5-HT的水平来达到抗抑郁治疗效果,本实验结果表明FTY720同样能够通过提高DA、5-HT及NE的含量达到抗抑郁的治疗效果。

单胺类神经递质及神经营养因子(BDNF)的降低均可导致抑郁发生。而炎症因子IL-1β、IL-6与TNF-α增多可过度激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,此过程可升高糖皮质激素水平〔16〕, 同时由于激活了吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)使边缘系统受到影响,神经递质5-HT和DA水平随之下降,并可以抑制胶质细胞释放BDNF〔17〕,这提示,炎症系统的激活可造成单胺类神经递质降低,其为抑郁的始动因素,也是疾病发生发展的主要因素。如果能通过免疫干预减轻炎症反应必然会减少单胺类神经递质及BDNF的下降,这是治疗抑郁的根本。目前免疫抑制治疗抑郁的研究仍然较少,有限的研究〔18〕显示,英夫利昔单抗为一种TNF-α拮抗剂,可以抑制炎症指标水平,从而缓解患者的抑郁症状。本研究结果显示,FTY720通过降低IL-1β、IL-6与TNF-α水平同样能够提高单胺类神经递质表达,与此同时还可以改善海马神经元损伤,最终实现抑郁治疗。

综上,FTY720能够有效改善海马神经元损伤并增加DA、5-HT和NE的表达进而缓解大鼠的抑郁行为,其机制可能是通过降低IL-1β、IL-6与TNF-α水平实现的。本团队下一步研究的重点为进一步探索FTY20是否能够治疗血管性痴呆,以期为临床提供更多更有力的证据。