棕色脂肪外泌体在2型糖尿病中的作用

阮晓劼

随着现代社会的不断进步,人们的生活水平也在不断改善,然而因不良生活习惯引起的代谢性疾病急剧上升[1-2]。其中,2型糖尿病(T2DM)是全球危害最大的代谢性疾病之一,糖尿病的多种并发症可以显著增加患者的致残和致死风险[3-4]。脂肪组织是调节系统能量代谢的重要器官,其代谢活动与T2DM的发展联系紧密。脂肪组织主要分为白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)[5]。BAT对体内葡萄糖稳态具有重大影响,与其他代谢活跃的组织相比,BAT在激活后具有较高的葡萄糖摄取率,研究发现,活化的BAT可以吸收和利用葡萄糖和脂质,从而改善β细胞功能,减少胰腺β细胞对胰岛素分泌的需求[6]。外泌体是一种良好的载体,其携带的微小RNAs(microRNAs,miRNAs)、蛋白质、细胞因子等可以参与远程调控和参与各种生物学过程[5-6]。近几年,BAT分泌的外泌体已成为T2DM防治策略的重要研究内容,本文就棕色脂肪和棕色脂肪外泌体在T2DM防治中的作用研究进行综述。

1 BAT应用于T2DM并发症的研究

1.1 BAT和T2DM心血管疾病:糖尿病患病率的升高伴随着血管疾病的增加。T2DM的微血管并发症包括视网膜病变、肾病和神经病变,大血管并发症包括早期动脉粥样硬化(AS),最终表现为心肌梗死、卒中和外周血管疾病[7]。T2DM患者AS出现更早,进展速度更快,病变更弥散、广泛,易累及远端血管,加速心脑血管疾病的进展,AS的预防及治疗一直是T2DM患者临床试验、治疗策略和临床实践指南的主要焦点[8]。目前,治疗糖尿病并发AS主要采用降血糖、调血脂、降血压、溶栓、抗凝等药物或外科手术介入等对症治疗手段,但存在临床疗效差、产生药物耐受及可能产生副作用的问题[9]。

通过大数据分析发现,体内有明显BAT或有BAT的T2DM患者的心脏代谢并发症患病率明显低于无明显BAT的T2DM患者[9],其冠状动脉疾病发病率、脑血管疾病发病率和充血性心力衰竭病发率都有明显降低[10],患者血液中的血糖、甘油三酯和高密度脂蛋白值均有改善[10]。通过向高脂喂养的小鼠移植BAT,研究人员观察到BAT对心肌梗死引起的葡萄糖耐受不良有保护作用,缓解T2DM心血管疾病的发展,同时左心室肥大症状减少[10]。通过冷刺激小鼠使其去甲状腺素释放,可以激活β3-肾上腺素能受体(β3-AR),从而提升小鼠BAT活性[11-12]。研究人员检测到BAT的活性被冷激活后,小鼠体内低密度脂蛋白胆固醇受体活性恢复,血浆低密度脂蛋白和胆固醇水平降低,从而有效减少血脂斑块的形成,以此减缓小鼠动脉粥样硬化症的病程发展[11]。因此,增加 BAT或激活BAT 被认为是T2DM发生心脏梗死的重要干预措施以及心脏重塑的治疗手段。

1.2 BAT和T2DM肾病:糖尿病肾脏疾病(DKD)是T2DM最常见的并发症,2020 年中华糖尿病学会调查显示,我国大约30%～40%的糖尿病患者会发生DKD,DKD的发展快速,如不及时治疗,肾脏病变将不可逆转。然而,药物治疗效果欠佳,预后不良[13]。DKD显著增加了T2DM患者死亡风险,因此,早预防、早诊断、早治疗对延缓DKD进展尤为重要。

研究人员通过移植BAT干预T2DM小鼠后发现,小鼠内源性BAT的活性和肾脏的下游信号通路AMPK-SIRT1-PGC1α被激活,从而抑制小鼠肾脏炎症和氧化应激,改善T2DM小鼠出现的肾脏炎症、纤维化及氧化应激的病理现象[14]。AMPK/PGC-1α信号通路被证实是调节线粒体功能、脂质代谢和细胞生长的关键机制,在T2DM的病理生理机制中起着至关重要的作用[15]。研究表明,高血糖可以通过直接抑制SIRT1降低PGC1α的信号传导功能,从而引起肾脏损伤[16]。因此激活AMPK-SIRT1-PGC1α通路的治疗方法被证实可以保护肾脏免受高血糖的损害[16]。BAT的激活可以增加肾脏对成纤维细胞生长因子Fgf21的敏感性,缓解内质网应激诱导的肝细胞脂肪变性,发挥肝脏保护作用[17]。Fgf21是调节全身脂质、葡萄糖和能量代谢的主要因子[18]。Fgf21可以抑制上皮细胞间充质转化,从而降低细胞外基质在肾内堆积,改善糖尿病导致的肾脏纤维化病变[18]。因此,BAT的激活近年被视为T2DM肾病前期防治的重点研究方向。

1.3 BAT和T2DM非酒精性脂肪性肝病:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和T2DM经常共存,相互进行协同作用。T2DM不仅增加了患者患NAFLD的风险,同时快速推进了NAFLD发展为非酒精性脂肪性肝炎、晚期纤维化或肝硬化的疾病过程[19]。研究发现,直接治疗NAFLD可以有效控制T2DM的病程发展,同时控制T2DM的病程发展也可以缓解NAFLD向恶性肝病发展[20]。

有研究表明,向T2DM小鼠移植BAT后,肝组织脂肪滴数量和胶原纤维沉积明显减少,肝脏的氧化应激及纤维化有显著改善[21]。BAT移植可以改善小鼠的糖耐量,降低胰岛素抵抗[22]。胰岛素抵抗会引起血糖升高,促进脂肪而在肝脏沉积,导致肝脏脂肪样变出现脂肪肝[23]。因此胰岛素抵抗降低有助于减轻肝脂肪变性。同时,根据对棕色脂肪分泌成分研究分析,研究人员发现,BAT可以通过调控神经调节蛋白4 (Nrg4)来控制肝脏中脂质的产生。Nrg4与肝细胞上的ErbB受体结合,可减少糖向脂肪转化[24]。Nrg4是一种主要由BAT表达的新型脂肪因子,其可作用于肝脏参与机体糖脂代谢调节[24]。研究发现,在原代小鼠肝细胞中Nrg4与 ErbB3/ErbB4信号传导有直接关系[25]。此外,在NASH小鼠模型中观察到Nrg4缺乏与肝纤维化和肝脏炎症程度增加有关[25]。通过在小鼠中基因过表达Nrg4,研究人员发现,小鼠因高脂饮食诱导的体重增加、胰岛素抵抗和肝脏脂肪生成等病理现象被改善,因此Nrg4与ErbB受体结合被用于减缓限制NAFLD向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发展研究[25]。BAT细胞被激活后,BAT分泌Nrg4 的含量升高,肝脏脂肪含量降低,NAFLD进程明显减缓[24]。BAT应用于减慢NAFLD进程已被充分证实,其具体作用机制研究现被重点关注。

2 棕色脂肪源性外泌体的成分与生物学功能

2.1 脂肪源性外泌体的成分:外泌体是一种小而不均匀的微囊泡,由于其携带蛋白质、脂质和核酸等多种物质,并影响受体细胞的功能,近年来引起了广泛的关注。外泌体含有蛋白质、脂肪和核酸的脂质双层囊泡,大小为 40～100 nm[26]。外泌体特殊的膜结构可以保护其携带的内分泌因子能够在细胞外环境中稳定存在,从而通过细胞间通信的方式对靶细胞进行邻近或远程调控[27]。

脂肪组织被认为是最大的内分泌器官[28]。有研究指出,脂肪组织可通过分泌外泌体与全身器官以及其他细胞等进行信息交换,通过影响靶组织的生理功能调节参与血管生成、免疫调节、组织再生、代谢稳态和损伤修复[28]。脂肪组织中多种类型的细胞,包括脂肪细胞、巨噬细胞、脂肪干细胞和内皮细胞分泌的外泌体同时会以一种旁分泌或内分泌的方式介导细胞间和器官间的串扰,调节脂肪组织和系统内稳态[29]。

不同种类的脂肪细胞产生的外泌体具有不同的生理功能。研究表明,T2DM并发脂质代谢障碍时,脂肪组织分泌对血管内皮细胞具有损伤作用的外泌体水平升高[29]。脂肪组织巨噬细胞在脂肪组织细胞中分泌的外泌体可产生促炎介质,诱导脂肪细胞功能障碍缺陷和代谢异常[30]。该外泌体中的Mir-34a可参与不同组织的基因表达,促进端粒缩短,从而促进细胞死亡[31]。脂肪组织源性间充质干细胞可以促进组织修复和功能改善[29]。脂肪巨噬细胞的负面作用更多,主要影响代谢过程和器官组织损伤[30]。脂肪组织中的巨噬细胞和间充质干细胞分泌的外泌体为研究脂肪外泌体的主要来源。脂肪外泌体除了携带脂肪细胞特异性分泌的蛋白外,同时包含多种肿瘤坏死因子、巨噬细胞集落刺激因子、参与免疫调节的蛋白以及信使RNAs (mRNAs)和 miRNAs,其中大多数循环中的 miRNAs被发现来自脂肪细胞,因此,脂肪外泌体携带的各种蛋白和miRNAs作为疾病标志物被重点挖掘[29]。

2.2 棕色脂肪源性外泌体的生物学功能:BAT是一种高度代谢活跃的脂肪组织形式,在产热维持代谢健康中起着关键作用,但是BAT的分泌功能很少受到关注。BAT介导了重要的内分泌功能,研究发现,BAT可以分泌外泌体,当BAT被刺激后,BAT释放到循环中的外泌体数量会发生显著变化[32]。例如,人类BAT受到冷诱导或肾上腺素刺激后,BAT分泌外泌体的数量有显著增加[32]。

BAT分泌的外泌体作为载体的运输途径和其内容物被重点研究:①BAT外泌体作为运输炎症因子载体,主要通过干预BAT外泌体与器官之间信息交流的方式来调控T2DM并发症的发展进程;②BAT外泌体内的生物活性因子具有不同的生理特性,通过研究BAT外泌体体内的生物活性物质可以帮助挖掘调控T2DM并发症的新生物标志物。

2.3 棕色脂肪源性外泌体和T2DM:研究发现,通过直接激活和移植BAT,它可以正向调控T2DM并发症的病程发展,因此,棕色脂肪改善T2DM并发症的途径和关键生物活性因子被重点研究[6]。其中外泌体作为常见的旁分泌物质被关注。通过向高脂饲养的小鼠静脉注射棕色脂肪外泌体,检测发现棕色脂肪外泌体主要聚集于小鼠的心脏,肝脏和肾脏部位[33]。

棕色脂肪外泌体被发现可以调控由脂质代谢和糖代谢异常引发的心血管系统功能损伤。BAT分泌的外泌体可以直接被心脏吸收[33]。研究还发现,向高脂饲养的小鼠注射BAT分泌的外泌体后,小鼠受损的心脏收缩功能被改善,小鼠二尖瓣环的E′/A′比值恢复,心脏功能有所改善[35]。诱导型 NOS(iNOS)在炎症条件下被高表达,iNOS的高表达促进一氧化氮(NO)产生,对心血管系统起保护作用[34]。NO可以调节血压和血管张力,抑制血小板聚集和白细胞黏附,防止平滑肌细胞增殖[34]。NO的生物利用度降低被认为是心血管疾病常见的中心因素之一,常被认为与内皮功能障碍有关[34]。在病理情况下,iNOS 的低表达导致NO含量降低被认为是动脉粥样硬化等心血管系统疾病的重要诱因[34]。通过敲除BAT 中 ADRB3 基因后,发现BAT分泌的外泌体中iNOS的表达和含量降低,最终可以导致心脏功能障碍。因此,通过反向升高BAT中ADRB3 基因表达,小鼠心脏功能可以被改善[35]。

BAT来源外泌体miRNAs可以调控肾功能。研究发现,BAT移植可重新激活内源性BAT并纠正糖尿病小鼠的高脂血症,这些作用是通过脂肪因子与脂肪外泌体转运的miR-30b联合作用的,激活肾脏AMPK-SIRT1-PGC1α轴介导[36]。AMPK-SIRT1-PGC1α轴被激活后,线粒体质量得到控制,肾小管细胞凋亡现象减少,最终可改善肾脏内的能量代谢平衡[37]。BAT通过大量释放miR-30b,直接抑制肾脏Runx1和Snail1(蛋白)的表达,从而改善肾脏纤维化[36]。因此,BAT分泌miR-30b被认为是改善糖尿病期间肾组织纤维化的关键因子。NOX4在肝脏中主要表达的一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOXs),是活性氧(ROS)的主要来源[38]。NOX4被激活后可产生细胞外基质从而促进肝纤维化和肝硬化[38]。通过研究发现,在脂肪特异性敲除miRNA加工酶Dicer小鼠的BAT移植后,小鼠脂肪组织循环外泌体中携带的miR-99a和miR-99b的水平显著升高[41]。通过转染miR-99a mimic后,发现NOX4蛋白的表达显著降低,而转染miR-99a inhibitor可逆转NOX4蛋白的表达[38]。由此证实,BAT分泌的外泌体可以通过上调miR-99a水平,靶向抑制NOX4基因的表达,从而减缓细胞外基质的形成,减速肝损伤和纤维化的病理发展过程[38]。

BAT来源外泌体可以显著改善脂肪肝和由代谢异常导致的肝功能障碍。动物实验结果表明,注射BAT-Exos的高脂饲养小鼠的肝功能受损问题被缓解[26]。同时与BAT-Exos共培养的肝细胞耗氧量显著增加,肝细胞的能量消耗和代谢能力被促进,可以有效改善脂质代谢和糖代谢异常的问题[26]。由于外泌体的功能会跟随生物体内环境的变化而产生改变,冷应激实验被用来观察激活BAT后BAT来源的外泌体miRNAs的变化。研究发现,冷应激刺激BAT后,BAT来源的外泌体中miR-132-3p被显著诱导,当BAT靶向肝脏器官后,高表达miR-132-3p 基因的BAT-Exos可以刺激肝脏脂肪生成基因Srebf1的表达,以此调节肝脏脂肪生成以适应寒冷[39]。该研究证实肝脏脂肪生成基因Srebf1是miR-132-3p靶标,且可以通过调控BAT-Exos表达miR-132-3p来调控肝脏脂肪生成[30]。越来越多的研究表明,外泌体参与了DKD相关的病理生理过程,这为DKD提供新的生物标志物和治疗靶点。

在病理条件下,棕色脂肪细胞比白色脂肪细胞更容易发生凋亡现象,进而导致棕色脂肪释放大量炎症因子和包含炎症因子的外泌体。在脂质过载引发的炎症环境中,棕色脂肪细胞比白色脂肪细胞更容易发生凋亡现象,携带炎症因子的棕色脂肪源性外泌体,对T2DM并发症的疫应答过程有重要的调节作用[26]。目前研究外泌体应用于临床常见疾病的潜在发病机制还存在以下主要问题。首先,临床样本分泌的外泌体的来源难以追溯,直接获取的BAT所分泌的外泌体内容物会根据生物体内环境的改变和培养环境的改变而改变,具有差异性,在探究具体调控病变的因子上有较大难度;其次,外泌体的分离纯度要求很高,分离外泌体要达到用于研究的纯度与浓度十分困难,常存在得率低和提取过程复杂等问题,严重影响提取的外泌体的活性和纯度;最后,使用外泌体治疗的安全性不确定,由于外泌体携带大量核酸与生物活性分子,因此,外泌体用于生物体治疗时,是否会存在免疫相关的移植物抗宿主反应还需更多实验进行验证。

加强对外泌体组成与生物学功能的研究,深入探究BAT分泌的外泌体对T2DM并发症的调控,有助于进一步解析T2DM并发症的病因与发病机制,同时对辅助减缓T2DM病程进展和提高T2DM患者生活质量及生存率具有重要指导意义。